鎘對(duì)河南華溪蟹脂肪積累與代謝的影響及毒性機(jī)制研究.pdf

1、近年來(lái)，由于采礦、發(fā)電以及金屬冶煉等現(xiàn)代工業(yè)的快速發(fā)展，重金屬污染尤其是鎘的污染事件時(shí)有發(fā)生，使生物種群和生態(tài)系統(tǒng)受到嚴(yán)重破壞。研究發(fā)現(xiàn)，鎘可以影響生物有機(jī)體內(nèi)的物質(zhì)和能量代謝等過(guò)程，嚴(yán)重時(shí)甚至改變物種的遷徙和卵子發(fā)生等與繁殖相關(guān)的生命活動(dòng)。卵子發(fā)生是甲殼動(dòng)物卵巢發(fā)育中的一個(gè)重要階段，卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中卵黃磷蛋白原（Vitellogenin，Vg）的形成和積累是其主要特征。Vg通過(guò)進(jìn)一步的修飾和加工形成包含有脂肪和糖類等物質(zhì)的卵黃磷蛋白

2、（Vitellin，Vn）可在卵母細(xì)胞中積累形成卵黃體。當(dāng)生物有機(jī)體受到外部環(huán)境脅迫時(shí)，通過(guò)消耗體內(nèi)積累的脂肪等物質(zhì)產(chǎn)生充足的能量以合成金屬硫蛋白（Metallothionein，MT）以緩解外部的影響。還原型輔酶Ⅱ（NADPH）作為生物體內(nèi)一種重要的還原力，不僅參與維持體內(nèi)谷胱甘肽系統(tǒng)的平衡、緩解外部的脅迫，還是脂肪合成中的重要因素。
　　本學(xué)位論文在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，從細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和生物化學(xué)等多層次綜合研究并分

3、析了鎘亞慢性染毒后，對(duì)河南華溪蟹（Sinopotamon henanense）肝胰腺和卵巢組織中脂肪代謝的影響，闡明了鎘對(duì)生殖的影響機(jī)制。表明鎘對(duì)水生動(dòng)物早期影響的生化和繁殖參數(shù)，可以作為在水生生態(tài)毒理學(xué)研究中污染物對(duì)生物種群影響的重要指標(biāo)和科學(xué)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)中具體利用了比色法、透射電鏡技術(shù)(Transmission electron microscopy，TEM)、免疫學(xué)和凝膠過(guò)濾層析等方法。主要的生化指標(biāo)包括脂肪含量、甘油三酯（Trig

4、lyceride，TG）含量、ATP/ADP、NADH/NAD、線粒體膜電位（△ψm）、NADPH/NADP+等參數(shù)；脂肪消化代謝相關(guān)的胰脂肪酶（Pancreatic lipase，PL）、脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的脂蛋白脂肪酶（Lipoprotein lipase，LPL）及參與脂肪合成代謝的乙酰CoA羧化酶（Acetyl-CoA carboxylase，ACC）和脂肪酸合成酶（Fatty acid synthase，F(xiàn)AS）；線粒體能量合成代謝

5、相關(guān)的己糖激酶（Glucokinase，GK）、NAD+-異檸檬酸脫氫酶（NAD+-linked isocitrate dehydrogenase，NAD+-IDH）、細(xì)胞色素C氧化酶（Cytochrome C oxidase，COX）等酶的活性及IDH和COX mRNA表達(dá)；NADPH合成依賴酶：葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（Glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH）、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6-pho

6、sphogluconate dehydrogenase，6PGDH）、蘋果酸酶（Malic enzyme，ME）、NADP+依賴型異檸檬酸脫氫酶（ NADP+-linked isocitrate dehydrogenase，NADP+-IDH）等酶的活性；參與緩解氧化脅迫的谷胱甘肽系統(tǒng)：還原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量、GSH/GSSG、谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase，GR）活性、MT

7、和脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)丙二醛（Malondialdehyde，MDA）。采用TEM手段觀察了鎘處理后肝胰腺細(xì)胞線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等顯微結(jié)構(gòu)的改變。應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法，確定了Vg的核酸序列全長(zhǎng)，通過(guò)生物信息學(xué)的方法對(duì)Vg進(jìn)行了分析；基于逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）方法，研究了該基因在不同組織內(nèi)的表達(dá)，并通過(guò)Vg序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹；通過(guò)凝膠過(guò)濾層

8、析法純化了成熟卵巢中的Vn，采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳確定了Vn亞基數(shù)量及分子量；以純化的Vn為抗原，制備了Vn多克隆抗血清，并建立了可靠的Vn含量測(cè)定的ELISA方法；最后，運(yùn)用酶聯(lián)免疫和實(shí)時(shí)熒光定量PCR等多種方法檢測(cè)了鎘暴露對(duì)肝胰腺和卵巢等組織中Vn含量、Vg mRNA表達(dá)及糖代謝和蛋白代謝的影響。結(jié)果顯示：
　　首先，鎘在河南華溪蟹組織中的蓄積具有濃度和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。隨著鎘處理濃度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，肝胰腺和卵巢中

9、鎘的蓄積量呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，而脂肪的含量則呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，導(dǎo)致肝胰腺和卵巢指數(shù)的降低進(jìn)而影響了組織器官的發(fā)育。鎘處理10d，淋巴液中TG含量顯著高于對(duì)照，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢(shì)。參與脂肪消化的PL和脂肪合成的ACC和FAS酶活高于對(duì)照組；鎘處理20d，PL、LPL、ACC和FAS活性均低于10d的鎘處理組和對(duì)照組，并隨著鎘濃度的升高呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。
　　其次，與對(duì)照組相比，鎘處理10d后的各染毒組組織細(xì)胞內(nèi)NAD+-IDH和

10、COX活性的增強(qiáng)及mRNA表達(dá)水平的上調(diào)，引起了NADH含量及NADH/NAD的顯著增高，并由此導(dǎo)致了高水平的△ψm及ATP含量上升。然而，隨著鎘處理時(shí)間的延長(zhǎng)，參與能量代謝的GK、IDH和COX酶活性及相關(guān)酶mRNA表達(dá)水平下降，且在鎘處理20d該指標(biāo)顯著低于對(duì)照組。TEM觀察發(fā)現(xiàn)，線粒體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)腫脹、膜破裂、內(nèi)膜嵴變短、線粒體破裂和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷等現(xiàn)象，使組織細(xì)胞中的NADH含量和△ψm水平下降，最終導(dǎo)致ATP含量減少。
　　還有

11、，鎘處理早期，G6PDH、6PGDH、ME和NADP-IDH等酶活性升高加速了磷酸戊糖代謝等NADPH合成途徑，引起組織中NADPH含量上升；GR活力顯著升高導(dǎo)致谷胱甘肽氧化還原循環(huán)再生途徑得到加強(qiáng)，GSH合成速率升高。MT含量的顯著升高也表明在該階段蟹體具有較強(qiáng)的抗鎘脅迫能力。然而，隨著鎘處理時(shí)間的延長(zhǎng)，體內(nèi)NADPH及GSH的合成代謝逐漸減弱。鎘處理20d，NADPH合成依賴的酶活力受到抑制，引起 NADPH含量降低，谷胱甘肽氧化還

12、原循環(huán)再生途徑也因此受阻；GR活性由于受到鎘的脅迫而出現(xiàn)降低。因此，鎘對(duì)NADPH合成及谷胱甘肽原循環(huán)中關(guān)鍵酶GR活性的抑制，導(dǎo)致GSH合成速率下降，并最終引發(fā)GSH含量的降低和耗竭。組織內(nèi)MT含量的降低和MT mRNA表達(dá)的下調(diào)表明，組織細(xì)胞螯合鎘的能力減弱，MDA含量顯著升高表明在該階段蟹體處于嚴(yán)重的氧化脅迫狀態(tài)。
　　另外，河南華溪蟹Vg基因序列長(zhǎng)度為7764bp，其中閱讀框核苷酸序列為7701bp可編碼2566個(gè)氨基酸；由

13、生物進(jìn)化樹分析得知，河南華溪蟹與中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）等蟹類在進(jìn)化上親緣關(guān)系較近而與蝦類進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果表明，該蛋白由分子量為102、84和70KD的3個(gè)亞基組成；溪蟹Vn-ELISA方法的工作濃度范圍為125-2000ng/mL，定性檢測(cè)的靈敏度可達(dá)到15.62ng/mL。同時(shí)，卵巢中Vn含量的測(cè)定結(jié)果中各批次間不存在顯著差異，且平均變異系數(shù)分別僅為7.81％，顯示該法具有較高的

14、穩(wěn)定性和重復(fù)性。鎘暴露引起卵巢組織卵母細(xì)胞直徑的降低，同時(shí)肝胰腺和卵巢Vg-mRNA表達(dá)下調(diào)，組織內(nèi)Vn含量的顯著降低，與鎘處理時(shí)間具有時(shí)間-效應(yīng)和濃度-效應(yīng)關(guān)系；經(jīng)鎘處理肝胰腺和卵巢組織內(nèi)糖原及蛋白含量顯著低于對(duì)照組的，其中在鎘暴露15d谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性增強(qiáng)，表明鎘處理后蟹體需要分解糖類、蛋白質(zhì)等物質(zhì)以滿足能量的需求從而緩解鎘的脅迫。
　　由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出如下結(jié)論：
　　第一，鎘影響河南華溪蟹肝胰腺和卵巢內(nèi)的脂

15、肪積累；短期鎘暴露可以誘導(dǎo)脂肪消化和脂肪合成代謝相關(guān)酶活性升高，促進(jìn)脂類的消化、吸收和合成；長(zhǎng)期鎘暴露，顯著影響脂肪消化、脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)以及脂肪合成代謝等過(guò)程，進(jìn)而阻礙了對(duì)體內(nèi)脂肪的積累并最終影響肝胰腺和卵巢的發(fā)育。
　　第二，短期鎘處理促進(jìn)了河南華溪蟹肝胰腺和卵巢細(xì)胞內(nèi)的線粒體能量代謝，具體表現(xiàn)為應(yīng)激反應(yīng)。該反應(yīng)有利于機(jī)體內(nèi)脂肪酸的合成，并緩解脂質(zhì)過(guò)氧化作用對(duì)細(xì)胞膜的損傷；但是，隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng)，河南華溪蟹組織細(xì)胞內(nèi)的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

16、結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，參與能量合成代謝關(guān)鍵酶的活性降低、能量合成相關(guān)基因mRNA表達(dá)受到抑制。表明鎘阻礙了線粒體的呼吸鏈，最終影響了組織內(nèi)的能量合成，并造成機(jī)體內(nèi)ATP供應(yīng)受阻。
　　第三，短期鎘處理，對(duì)河南華溪蟹組織內(nèi)的NADPH合成有促進(jìn)作用，誘導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)還原力的生成。同時(shí)GSH合成速率升高，細(xì)胞內(nèi)的抗氧化能力和抗鎘脅迫能量加強(qiáng)；長(zhǎng)期鎘處理，則會(huì)抑制組織中還原力的生成，造成機(jī)體內(nèi)還原型谷胱甘肽含量降低、抗氧化水平減弱，最終影響體內(nèi)脂