鎘對河南華溪蟹血淋巴細胞的毒性效應及脂多糖的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、本博士學位論文以河南華溪蟹（Sinopotamon henanense）的血淋巴細胞(hemocytes)為材料，研究了亞慢性鎘染毒對血淋巴細胞的毒性作用及免疫增強劑脂多糖的調(diào)節(jié)作用。實驗設置了3個鎘處理組（0.725、1.450和2.900mg/L）和一個空白對照組，分別處理7d、14d和21d。染毒后將蟹體平均分為兩組，其中一組個體用來研究鎘的毒性作用，另一組個體分別注射10μg/mL濃度的脂多糖用來研究脂多糖對鎘毒性的調(diào)節(jié)作用。首

2、先，采用透射電鏡技術(shù)(transmission electron microscope，TEM)觀察了血淋巴細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化及膜的完整性，從形態(tài)學角度探究鎘對血淋巴細胞超微結(jié)構(gòu)的損傷。其次，用血球計數(shù)板統(tǒng)計了血淋巴細胞的總數(shù)(total hemocyte counts，THC);采用火焰原子吸收儀檢測了血淋巴細胞中鎘的富集量;用比色法測定了活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)水平，酸性磷酸酶(acid

3、 phosphatase，ACP)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)和溶菌酶(lysozyme，LSZ)等溶酶體酶的活性;利用中性紅染色法測定了溶酶體膜的穩(wěn)定性，系統(tǒng)研究了由于鎘的富集引起ROS水平升高而進一步介導的血淋巴細胞生理生化功能的變化，以及脂多糖對這種變化的調(diào)節(jié)作用。在此基礎上，為了研究抗氧化酶活性和氧化損傷程度，用購置的生化試劑盒測定了總抗氧化能力(total antioxidant capac

4、ity，T-AOC)、抗氧化酶:超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)和過氧化物酶(peroxidase，POD)活性的變化及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyde，MDA)的含量。此外，采用2，4-二硝基苯肼(DNPH)比色法測定了蛋白質(zhì)羰基(protein carbonyl d

5、erivates，PCO)含量，用KCL-SDS沉淀法檢測了DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)率(DNA-protein crosslink，DPC)。最后，利用實時熒光定量PCR法對免疫相關(guān)基因酚氧化酶原（prophenoloxidase，簡稱proPO）、溶菌酶(lysozyme，簡稱LSZ)和金屬硫蛋白（metallothionein簡稱MT）三種基因mRNA表達水平的變化，用比色法測定了PO的活性，從分子水平上研究了鎘脅迫的應答機制及脂多糖的調(diào)

6、節(jié)作用，闡述了鎘對河南華溪蟹免疫系統(tǒng)的毒性作用及致毒機制。
　　研究結(jié)果包括以下四個方面:
　　1.鎘對河南華溪蟹血淋巴細胞超微結(jié)構(gòu)的影響
　　根據(jù)細胞的整體形態(tài)、胞質(zhì)中的顆粒數(shù)目及其大小可將河南華溪蟹血淋巴細胞分為三類:大顆粒細胞、小顆粒細胞和無顆粒細胞。其中大顆粒細胞的體積較大、細胞核較小、胞質(zhì)中有較多的電子密度顆粒，而且各類細胞器較多;小顆粒細胞體積稍小，胞質(zhì)中含少量顆粒;無顆粒細胞體積一般較小，幾乎無顆粒，較少

7、觀察到細胞器。鎘暴露可以引起溪蟹顆粒細胞進行脫顆粒，細胞核變形、染色質(zhì)濃縮，線粒體出現(xiàn)了嵴斷裂、空泡化甚至消失的現(xiàn)象，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的腔擴張、其上的核糖體脫落，溶酶體膜模糊甚至破裂。另外還發(fā)現(xiàn)，高濃度組(2.900mg/L)鎘暴露時間由7d延長至21d時，血淋巴細胞超微結(jié)構(gòu)的損傷程度較低濃度組(0.725mg/L)的嚴重。
　　2.鎘處理對河南華溪蟹血淋巴細胞免疫相關(guān)因子的影響及脂多糖的調(diào)節(jié)作用
　　河南華溪蟹血淋巴細胞鎘的富集

8、量隨著染毒濃度的增加和暴露時間的延長，呈現(xiàn)上升趨勢，并且有劑量-效應。鎘導致溪蟹血淋巴細胞總數(shù)顯著下降，ROS水平顯著上升，溶酶體膜的穩(wěn)定性下降。除LSZ外，鎘暴露引起了血淋巴細胞中的ACP和AKP活性均升高;鎘染毒后再注射脂多糖，與鎘單獨作用相比，脂多糖引起溪蟹血淋巴細胞總數(shù)下降，ROS在一定程度上降低，溶酶體膜的穩(wěn)定性也下降，ACP和AKP活力均升高，LSZ活力無顯著變化。
　　3.鎘脅迫對河南華溪蟹血淋巴細胞抗氧化酶和氧化損

9、傷的影響及脂多糖的調(diào)節(jié)作用
　　河南華溪蟹血淋巴細胞中抗氧化酶SOD、CAT、GPx和POD的活性隨著鎘濃度的增加和處理時間的延長而整體上呈現(xiàn)出“先升高后降低”的趨勢，即低濃度鎘(0.725mg/L)顯著誘導抗氧化酶活性升高，高濃度鎘(2.900mg/L)抑制了酶活性。脂多糖作用后，四種酶活性在不同程度上均低于其相應的鎘處理組的活性。血淋巴細胞中的氧化損傷指標:PCO、DPC和MDA含量均呈現(xiàn)逐漸升高趨勢。與鎘單獨作用相比，鎘暴露

10、后再注射脂多糖，三個氧化損傷指標出現(xiàn)不同程度的下降，然而鎘暴露時間延長至21d時，各氧化損傷指標無顯著下降趨勢，脂多糖在一定程度上減輕鎘導致的氧化損傷效應。
　　4.河南華溪蟹血淋巴細胞對鎘的免疫應答及脂多糖的調(diào)節(jié)作用
　　隨著鎘濃度的增加或者暴露時間的延長，河南華溪蟹血淋巴細胞中proPO mRNA的表達量在整體上呈現(xiàn)下降趨勢，與鎘單獨作用相比，脂多糖作用后，proPO mRNA的表達量升高。PO活性在整個處理過程中呈現(xiàn)“

11、先升后降”趨勢。鎘暴露后注射脂多糖，與相應的鎘單獨處理組相比，PO活性在整體上呈現(xiàn)下降趨勢。鎘誘導溪蟹血淋巴細胞中的LSZ mRNA表達水平均升高，并呈現(xiàn)出劑量-效應。鎘暴露后注射脂多糖，與相應的鎘單獨處理組相比，LSZ mRNA表達水平出現(xiàn)不同程度的下降趨勢。此外，隨著暴露時間的延長或者鎘濃度的增加，MT mRNA的表達水平有升高趨勢，并呈現(xiàn)時間和劑量-效應。鎘暴露后再注射脂多糖時，與相應的鎘作用組相比，MT mRNA的表達水平呈下降

12、趨勢。
　　研究結(jié)果表明:
　　1.鎘脅迫改變了河南華溪蟹血淋巴細胞的超微結(jié)構(gòu)，其中高濃度鎘暴露對血淋巴細胞造成的損傷更嚴重，說明血淋巴細胞是鎘毒性作用的靶器官，這些結(jié)構(gòu)上的損傷可能會影響免疫相關(guān)因子正常的合成和分泌，導致溪蟹失去正常的免疫功能。
　　2.由于鎘在河南華溪蟹血淋巴細胞的富集而引起了ROS水平的升高，而ROS進一步對溶酶體造成損壞，釋放溶酶體酶;而脂多糖會降低ROS水平，在一定程度上能增強蟹體的免疫能力。