鎘對(duì)河南華溪蟹血淋巴細(xì)胞的毒性效應(yīng)及脂多糖的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、本博士學(xué)位論文以河南華溪蟹（Sinopotamon henanense）的血淋巴細(xì)胞(hemocytes)為材料，研究了亞慢性鎘染毒對(duì)血淋巴細(xì)胞的毒性作用及免疫增強(qiáng)劑脂多糖的調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)設(shè)置了3個(gè)鎘處理組（0.725、1.450和2.900mg/L）和一個(gè)空白對(duì)照組，分別處理7d、14d和21d。染毒后將蟹體平均分為兩組，其中一組個(gè)體用來(lái)研究鎘的毒性作用，另一組個(gè)體分別注射10μg/mL濃度的脂多糖用來(lái)研究脂多糖對(duì)鎘毒性的調(diào)節(jié)作用。首

2、先，采用透射電鏡技術(shù)(transmission electron microscope，TEM)觀察了血淋巴細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化及膜的完整性，從形態(tài)學(xué)角度探究鎘對(duì)血淋巴細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損傷。其次，用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)了血淋巴細(xì)胞的總數(shù)(total hemocyte counts，THC);采用火焰原子吸收儀檢測(cè)了血淋巴細(xì)胞中鎘的富集量;用比色法測(cè)定了活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)水平，酸性磷酸酶(acid

3、 phosphatase，ACP)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)和溶菌酶(lysozyme，LSZ)等溶酶體酶的活性;利用中性紅染色法測(cè)定了溶酶體膜的穩(wěn)定性，系統(tǒng)研究了由于鎘的富集引起ROS水平升高而進(jìn)一步介導(dǎo)的血淋巴細(xì)胞生理生化功能的變化，以及脂多糖對(duì)這種變化的調(diào)節(jié)作用。在此基礎(chǔ)上，為了研究抗氧化酶活性和氧化損傷程度，用購(gòu)置的生化試劑盒測(cè)定了總抗氧化能力(total antioxidant capac

4、ity，T-AOC)、抗氧化酶:超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)和過(guò)氧化物酶(peroxidase，POD)活性的變化及脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyde，MDA)的含量。此外，采用2，4-二硝基苯肼(DNPH)比色法測(cè)定了蛋白質(zhì)羰基(protein carbonyl d

5、erivates，PCO)含量，用KCL-SDS沉淀法檢測(cè)了DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)率(DNA-protein crosslink，DPC)。最后，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對(duì)免疫相關(guān)基因酚氧化酶原（prophenoloxidase，簡(jiǎn)稱proPO）、溶菌酶(lysozyme，簡(jiǎn)稱LSZ)和金屬硫蛋白（metallothionein簡(jiǎn)稱MT）三種基因mRNA表達(dá)水平的變化，用比色法測(cè)定了PO的活性，從分子水平上研究了鎘脅迫的應(yīng)答機(jī)制及脂多糖的調(diào)

6、節(jié)作用，闡述了鎘對(duì)河南華溪蟹免疫系統(tǒng)的毒性作用及致毒機(jī)制。
　　研究結(jié)果包括以下四個(gè)方面:
　　1.鎘對(duì)河南華溪蟹血淋巴細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響
　　根據(jù)細(xì)胞的整體形態(tài)、胞質(zhì)中的顆粒數(shù)目及其大小可將河南華溪蟹血淋巴細(xì)胞分為三類:大顆粒細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞和無(wú)顆粒細(xì)胞。其中大顆粒細(xì)胞的體積較大、細(xì)胞核較小、胞質(zhì)中有較多的電子密度顆粒，而且各類細(xì)胞器較多;小顆粒細(xì)胞體積稍小，胞質(zhì)中含少量顆粒;無(wú)顆粒細(xì)胞體積一般較小，幾乎無(wú)顆粒，較少

7、觀察到細(xì)胞器。鎘暴露可以引起溪蟹顆粒細(xì)胞進(jìn)行脫顆粒，細(xì)胞核變形、染色質(zhì)濃縮，線粒體出現(xiàn)了嵴斷裂、空泡化甚至消失的現(xiàn)象，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的腔擴(kuò)張、其上的核糖體脫落，溶酶體膜模糊甚至破裂。另外還發(fā)現(xiàn)，高濃度組(2.900mg/L)鎘暴露時(shí)間由7d延長(zhǎng)至21d時(shí)，血淋巴細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損傷程度較低濃度組(0.725mg/L)的嚴(yán)重。
　　2.鎘處理對(duì)河南華溪蟹血淋巴細(xì)胞免疫相關(guān)因子的影響及脂多糖的調(diào)節(jié)作用
　　河南華溪蟹血淋巴細(xì)胞鎘的富集

8、量隨著染毒濃度的增加和暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，并且有劑量-效應(yīng)。鎘導(dǎo)致溪蟹血淋巴細(xì)胞總數(shù)顯著下降，ROS水平顯著上升，溶酶體膜的穩(wěn)定性下降。除LSZ外，鎘暴露引起了血淋巴細(xì)胞中的ACP和AKP活性均升高;鎘染毒后再注射脂多糖，與鎘單獨(dú)作用相比，脂多糖引起溪蟹血淋巴細(xì)胞總數(shù)下降，ROS在一定程度上降低，溶酶體膜的穩(wěn)定性也下降，ACP和AKP活力均升高，LSZ活力無(wú)顯著變化。
　　3.鎘脅迫對(duì)河南華溪蟹血淋巴細(xì)胞抗氧化酶和氧化損

9、傷的影響及脂多糖的調(diào)節(jié)作用
　　河南華溪蟹血淋巴細(xì)胞中抗氧化酶SOD、CAT、GPx和POD的活性隨著鎘濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)而整體上呈現(xiàn)出“先升高后降低”的趨勢(shì)，即低濃度鎘(0.725mg/L)顯著誘導(dǎo)抗氧化酶活性升高，高濃度鎘(2.900mg/L)抑制了酶活性。脂多糖作用后，四種酶活性在不同程度上均低于其相應(yīng)的鎘處理組的活性。血淋巴細(xì)胞中的氧化損傷指標(biāo):PCO、DPC和MDA含量均呈現(xiàn)逐漸升高趨勢(shì)。與鎘單獨(dú)作用相比，鎘暴露

10、后再注射脂多糖，三個(gè)氧化損傷指標(biāo)出現(xiàn)不同程度的下降，然而鎘暴露時(shí)間延長(zhǎng)至21d時(shí)，各氧化損傷指標(biāo)無(wú)顯著下降趨勢(shì)，脂多糖在一定程度上減輕鎘導(dǎo)致的氧化損傷效應(yīng)。
　　4.河南華溪蟹血淋巴細(xì)胞對(duì)鎘的免疫應(yīng)答及脂多糖的調(diào)節(jié)作用
　　隨著鎘濃度的增加或者暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，河南華溪蟹血淋巴細(xì)胞中proPO mRNA的表達(dá)量在整體上呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，與鎘單獨(dú)作用相比，脂多糖作用后，proPO mRNA的表達(dá)量升高。PO活性在整個(gè)處理過(guò)程中呈現(xiàn)“

11、先升后降”趨勢(shì)。鎘暴露后注射脂多糖，與相應(yīng)的鎘單獨(dú)處理組相比，PO活性在整體上呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。鎘誘導(dǎo)溪蟹血淋巴細(xì)胞中的LSZ mRNA表達(dá)水平均升高，并呈現(xiàn)出劑量-效應(yīng)。鎘暴露后注射脂多糖，與相應(yīng)的鎘單獨(dú)處理組相比，LSZ mRNA表達(dá)水平出現(xiàn)不同程度的下降趨勢(shì)。此外，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)或者鎘濃度的增加，MT mRNA的表達(dá)水平有升高趨勢(shì)，并呈現(xiàn)時(shí)間和劑量-效應(yīng)。鎘暴露后再注射脂多糖時(shí)，與相應(yīng)的鎘作用組相比，MT mRNA的表達(dá)水平呈下降

12、趨勢(shì)。
　　研究結(jié)果表明:
　　1.鎘脅迫改變了河南華溪蟹血淋巴細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，其中高濃度鎘暴露對(duì)血淋巴細(xì)胞造成的損傷更嚴(yán)重，說(shuō)明血淋巴細(xì)胞是鎘毒性作用的靶器官，這些結(jié)構(gòu)上的損傷可能會(huì)影響免疫相關(guān)因子正常的合成和分泌，導(dǎo)致溪蟹失去正常的免疫功能。
　　2.由于鎘在河南華溪蟹血淋巴細(xì)胞的富集而引起了ROS水平的升高，而ROS進(jìn)一步對(duì)溶酶體造成損壞，釋放溶酶體酶;而脂多糖會(huì)降低ROS水平，在一定程度上能增強(qiáng)蟹體的免疫能力。