高表達(dá)Vps24對(duì)MLE12細(xì)胞生物學(xué)特性改變的初步分析.pdf

1、目的：
　　 Vps24(vacuolar protein sorting24)是轉(zhuǎn)運(yùn)必需內(nèi)吞體分選復(fù)合物(endosomalsorting complex required for transport，ESCRT)中ESCRT-Ⅲ復(fù)合物的重要組成部分。ESCRTs的主要功能包括，介導(dǎo)泛素化的內(nèi)吞體膜蛋白分選，形成多泡體(multivesicular body，MVBs)，并轉(zhuǎn)運(yùn)入溶酶體進(jìn)行降解，從而調(diào)控受體信號(hào)通路。它也能夠調(diào)

2、控胞質(zhì)分裂、病毒包裝、出芽及自噬等。ESCRTs由四類(lèi)具有不同生物學(xué)功能的蛋白復(fù)合物構(gòu)成，即ESCRTs-0，-Ⅰ，-Ⅱ，和-Ⅲ，它們通過(guò)精密的分工協(xié)作識(shí)別并分選泛素化膜受體[1]。ESCRT-Ⅲ是一種動(dòng)態(tài)多聚體，主要由四種核心亞基構(gòu)成，即Vps20，Snf7，Vps24和Vps2[2]。在MVBs形成過(guò)程中，Vps24與ESCRTs的其他成員共同作用，使囊泡膜內(nèi)化入腔，并實(shí)現(xiàn)腔內(nèi)囊泡與內(nèi)體膜的最終分離[3]，從而介導(dǎo)受體信號(hào)通路的調(diào)控

3、。
　　 Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞（typeⅡ alveolar epithelial cell，AEⅡ）是末梢肺組織中的重要細(xì)胞系，具有合成、分泌表面活性物質(zhì)(PS)，增殖分化以補(bǔ)充AEⅠ，及參與免疫調(diào)控等功能。體外研究表明，原代分離培養(yǎng)的AEⅡ，其特征分子SPC的表達(dá)和板層小體等會(huì)隨著時(shí)間的推移而逐漸降低，轉(zhuǎn)分化為AEⅠ[4，5]。而在體內(nèi)，AEⅡ是AEⅠ的祖細(xì)胞，隨著肺泡上皮的發(fā)育和分化，SPC的表達(dá)升高。由此可知，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)與維

4、持AEⅡ分泌PS有關(guān)。板層小體是AEⅡ合成分泌儲(chǔ)存PS的主要結(jié)構(gòu)，而多泡體是板層小體的前體[6]。也有文獻(xiàn)指出，ESCRTs對(duì)哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞的極性維持具有重要作用，敲除ESCRTs成員Tsg101可使上皮細(xì)胞失去極性[7]。因此，ESCRTs可能在末梢肺組織穩(wěn)態(tài)維持中具有重要作用。MLE12(MouseLung Epithelial12)細(xì)胞是AEⅡ的近似細(xì)胞系，以其為研究對(duì)象，用以探究AEⅡ在末梢肺組織穩(wěn)態(tài)維持中的重要作用。

5、　　 本課題以探尋Vps24的功能為核心，借助體外重組技術(shù)構(gòu)建表達(dá)載體，建立高表達(dá)Vps24的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，并初步分析高表達(dá)Vps24對(duì)MLE12細(xì)胞生物學(xué)特性的改變。
　　 方法：
　　 1、重組質(zhì)粒的構(gòu)建
　　 2、細(xì)胞培養(yǎng)
　　 3、基因轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定篩選
　　 4、Western Blotting
　　 5、碘化丙啶染色
　　 6、Realtime PCR
　　 7

6、、RT-PCR
　　 8、統(tǒng)計(jì)分析
　　 結(jié)果：
　　 1、成功構(gòu)建外源性高表達(dá)Vps24的重組質(zhì)粒
　　 將小鼠的Vps24全長(zhǎng)編碼區(qū)基因克隆入pcDNA3.1/myc-His-B真核表達(dá)載體
　　 2、成功建立外源性高表達(dá)Vps24的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系
　　 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入MLE12細(xì)胞并進(jìn)行穩(wěn)定篩選及鑒定，得到外源性高表達(dá)Vps24的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系M12V24
　　 3、外源性

7、高表達(dá)Vps24能夠增強(qiáng)ESCRTs行使胞質(zhì)分裂的能力
　　 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期可知，Vps24的過(guò)表達(dá)能夠增強(qiáng)ESCRTs行使胞質(zhì)分裂的能力，消解多倍體。
　　 4、外源性高表達(dá)Vps24顯著降低E-cadherin mRNA表達(dá)水平
　　 隨機(jī)選取的10個(gè)M12V24陽(yáng)性單克隆中，9個(gè)單克隆的E-cadherin mRNA表達(dá)水平均出現(xiàn)明顯的降低，提示Vps24的過(guò)表達(dá)可能影響MLE12細(xì)胞的分化。

8、r>　　 5、外源性高表達(dá)Vps24不能顯著增強(qiáng)Bleomycin誘發(fā)EMT
　　 (1) Bleomycin處理細(xì)胞后，在我們觀察的時(shí)間段內(nèi)，細(xì)胞形態(tài)均發(fā)生一定改變，并未出現(xiàn)明顯的上皮細(xì)胞表型變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞表型
　　 (2) Realtime PCR檢測(cè)可知，細(xì)胞并未發(fā)生Vimentin mRNA表達(dá)水平的明顯升高
　　 6、Tunicamycin誘發(fā)ER Stress體外模型的確立
　　 (1)通過(guò)活

9、細(xì)胞計(jì)數(shù)，確定Tunicamycin誘發(fā)ER Stress的最佳濃度為6ng/ml
　　 (2)通過(guò)檢測(cè)Bip mRNA表達(dá)水平及XBP-1剪切情況，確定Tunicamycin誘發(fā)ER Stress最佳時(shí)間為24小時(shí)
　　 7、ER Stress及Vps24過(guò)表達(dá)與ER Stress聯(lián)合作用均不能誘發(fā)EMT
　　 (1)在正常MLE12細(xì)胞培養(yǎng)條件下，經(jīng)Tunicamycin處理后，細(xì)胞并未由上皮細(xì)胞表型變?yōu)殚g質(zhì)

10、細(xì)胞表型
　　 (2) Realtime PCR檢測(cè)可知，細(xì)胞并未發(fā)生Vimentin mRNA表達(dá)水平的明顯升高
　　 結(jié)論：
　　 外源性高表達(dá)Vps24能夠增強(qiáng)ESCRTs行使胞質(zhì)分裂的能力，顯著降低MLE12細(xì)胞E-cadherin表達(dá)水平;在現(xiàn)有條件下，高表達(dá)Vps24不能使MLE12細(xì)胞對(duì)促纖維化試劑Bleomycin更為敏感;ER Stress與其聯(lián)合作用，不能促進(jìn)MLE12細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化，表明