根癌農(nóng)桿菌GW4砷氧化與砷趨化的關(guān)聯(lián)及AioR的調(diào)控功能.pdf

1、砷(Arsenic，As)是一種廣泛存在于自然界中的類(lèi)金屬，最常見(jiàn)的兩種形態(tài)為亞砷酸鹽[Arsenite，As(Ⅲ)]和砷酸鹽[Arsenate，As(Ⅴ)]。砷氧化細(xì)菌的砷氧化酶(AioBA)催化高毒性的As(Ⅲ)氧化成低毒性的As(Ⅴ)，而aioBA的表達(dá)受到三組份調(diào)控系統(tǒng)AioXSR的調(diào)控，其中AioR為轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白。目前發(fā)現(xiàn)一些砷氧化細(xì)菌可以利用砷氧化產(chǎn)生的能量促進(jìn)生長(zhǎng)，且具有趨向于As(Ⅲ)的現(xiàn)象，但As(Ⅲ)趨化的受體蛋白還

2、未被鑒定，且As(Ⅲ)趨化的機(jī)制尚不清楚。此外，加砷促長(zhǎng)的異養(yǎng)砷氧化細(xì)菌砷氧化影響的代謝路徑以及AioR是否可以調(diào)控其他代謝路徑也尚不清晰。
　　本研究以一株分離自砷污染的地下水沉積物中的砷氧化型根癌農(nóng)桿菌GW4為研究對(duì)象，該細(xì)菌具有極高的As(Ⅲ)抗性，且同時(shí)具有加砷促長(zhǎng)和趨向于As(Ⅲ)的表型。我們?cè)诩?xì)菌GW4基因組中共找到20個(gè)甲基趨化受體基因mcp，其中1個(gè)mcp位于砷基因島中。該mcp基因及其他趨化基因(cheA、che

3、Y2與fliG)受到As(Ⅲ)的誘導(dǎo)，且通過(guò)MEME網(wǎng)站在mcp啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)了AioR的結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)毛細(xì)管趨化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，野生株在0.5mmol/L-2mmol/L濃度下具有趨向于As(Ⅲ)的表型，而缺失mcp或aioR基因后細(xì)菌喪失了對(duì)As(Ⅲ)的趨化能力，互補(bǔ)株表型得到了回復(fù)，該結(jié)果表明mcp及aioR基因是細(xì)菌As(Ⅲ)趨化必須的。通過(guò)色氨酸熒光光譜法發(fā)現(xiàn)Mcp周質(zhì)感應(yīng)區(qū)可以特異性的結(jié)合As(Ⅲ)，但不可以結(jié)合As(Ⅴ)。以上結(jié)果

4、表明我們鑒定到了首個(gè)As(Ⅲ)趨化受體蛋白。通過(guò)lacZ報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)mcp基因在aioR突變株中不再受到As(Ⅲ)的誘導(dǎo)。通過(guò)細(xì)菌單雜交實(shí)驗(yàn)和凝膠遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)證明了AioR可以結(jié)合在mcp基因的啟動(dòng)子區(qū)從而激活mcp的表達(dá)，且通過(guò)DNA足跡法最終確定了AioR的精確結(jié)合位點(diǎn)。此外，我們發(fā)現(xiàn)mcp的缺失使細(xì)菌GW4加砷促長(zhǎng)的現(xiàn)象消失，且砷氧化效率及As(Ⅲ)抗性均降低。通過(guò)以上結(jié)果我們推測(cè)，Mcp參與了細(xì)菌的砷氧化，AioR

5、同時(shí)調(diào)控細(xì)菌砷氧化酶AioBA和As(Ⅲ)甲基趨化蛋白Mcp的活性，砷氧化和砷趨化可能是相互促進(jìn)的關(guān)系（圖A）。
　　在發(fā)現(xiàn)AioR可以調(diào)控砷氧化和砷趨化以后，我們聯(lián)想AioR是否還可能調(diào)控其他代謝路徑，因此我們通過(guò)iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)的方法分析了以下4組差異蛋白:GW4(+AsⅢ)/GW4(-AsⅢ)、GW4-△aioR(+AsⅢ)/GW4-△aioR(-AsⅢ)、GW4-△aioR(-AsⅢ)/GW4(-AsⅢ)和GW4-△a

6、ioR(+AsⅢ)/GW4(+AsⅢ)，其中每一組最終分別鑒定到41、71、82和168個(gè)差異蛋白。通過(guò)EMSA和熒光定量PCR在GW4菌中一共鑒定出了12個(gè)啟動(dòng)子具有AioR結(jié)合位點(diǎn)的基因，結(jié)合差異蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果及熒光定量PCR結(jié)果我們得出以下結(jié)論:1.AioR主要調(diào)控細(xì)菌的砷氧化，但可以同時(shí)調(diào)控其他與砷氧化相關(guān)的代謝通路;2.AioR通過(guò)調(diào)控細(xì)菌磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(Pst/Pho)從而使細(xì)菌可以更加經(jīng)濟(jì)有效的利用磷酸鹽(Pi)，從而彌補(bǔ)

7、磷酸鹽(Pi)的匱乏;3.AioR可以調(diào)控砷抗性基因(arsC、acr3)、肽聚糖再生基因anmK、脯氨酸合成基因proC和修復(fù)蛋白基因PIMT，從而賦予細(xì)菌GW4高砷抗性;4.AioR可以調(diào)控TCA循環(huán)，從而使細(xì)菌以砷氧化為主要產(chǎn)能途徑（圖B）。
　　綜上所述，本研究鑒定到了首個(gè)As(Ⅲ)趨化受體蛋白Mcp，并證明AioR可以調(diào)控細(xì)菌對(duì)As(Ⅲ)的趨化和氧化，砷趨化和砷氧化密切相關(guān)。此外，本研究首次報(bào)道了加砷促長(zhǎng)的異養(yǎng)砷氧化細(xì)菌