根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法選育甘油氧化酶高產(chǎn)菌株.pdf

1、甘油氧化酶(Glycerol Oxidase，GLOX)在氧氣存在的情況下，可將甘油氧化為甘油醛，同時產(chǎn)生過氧化氫。甘油氧化酶可以替代甘油激酶和甘油磷酸氧化酶對血液中的甘油三酯進(jìn)行測定。甘油氧化酶還可將乙二醇經(jīng)由羥乙醛氧化為乙二醛，可將乙醇酸氧化為乙醛酸。因?yàn)槊复呋磻?yīng)的速度快，無副產(chǎn)品產(chǎn)生，如將其用于工業(yè)生產(chǎn)乙二醛和乙醛酸，具有廣泛的應(yīng)用前景。
　　 日本曲霉是半知菌綱的絲狀真菌，是可以產(chǎn)生甘油氧化酶的重要菌種。為了提高甘油氧

2、化酶的產(chǎn)量，首先研究了日本曲霉產(chǎn)生甘油氧化酶的發(fā)酵培養(yǎng)條件。同時本研究中根據(jù)根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterlum tumefaciens)介導(dǎo)T—DNA轉(zhuǎn)化真菌引起插入突變的原理，建立了日本曲霉的高效遺傳轉(zhuǎn)化體系，為日本曲霉的功能基因組學(xué)研究以及篩選高產(chǎn)工業(yè)用菌株奠定了基礎(chǔ)。通過該系統(tǒng)得到了日本曲霉突變株，從突變株中篩選得到了甘油氧化酶高產(chǎn)菌株。
　　 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的絲狀真菌轉(zhuǎn)化，是通過將T—DNA攜帶的標(biāo)記基因隨機(jī)地插入絲

3、狀真菌的基因組，從而得到攜帶標(biāo)記基因的突變株。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的絲狀真菌轉(zhuǎn)化效率高于傳統(tǒng)的聚乙二醇方法，同時可以利用分生孢子作為轉(zhuǎn)化受體，這也是該方法具有優(yōu)勢的關(guān)鍵點(diǎn)。影響轉(zhuǎn)化效率的影響因素包括，預(yù)培養(yǎng)時是否加入乙酰丁香酮(AS)，農(nóng)桿菌的生長狀態(tài)，孢子懸浮液的濃度，共培養(yǎng)溫度，共培養(yǎng)時間等。本研究中采用攜帶質(zhì)粒pBI/hphII的農(nóng)桿菌EHA105侵染日本曲霉，同時摸索了各個因素對轉(zhuǎn)化效率的影響，最終確定了最佳侵染條件為農(nóng)桿菌培養(yǎng)至00

4、600為0.8，日本曲霉孢子懸浮液的濃度為108個/ml，各取100 μl混合涂布于覆蓋有微孔濾膜的IM培養(yǎng)基(含有200 μmol/L AS)上，于24℃共培養(yǎng)3d，在此條件下，每107個孢子可以得到88個轉(zhuǎn)化子。
　　 隨機(jī)選取了8個日本曲霉轉(zhuǎn)化子，提取基因組DNA，利用PCR和Southern雜交的方法從分子水平上檢測轉(zhuǎn)化子的陽性率和標(biāo)記基因的插入拷貝數(shù)。結(jié)果顯示陽性轉(zhuǎn)化率達(dá)到100％，同時標(biāo)記基因大都以多拷貝的形式插入到

5、了日本曲霉基因組中。另外隨機(jī)選取了9個同本曲霉轉(zhuǎn)化子，在不含抗生素的PDA培養(yǎng)基中連續(xù)傳代培養(yǎng)10次，再轉(zhuǎn)接到含有潮霉素B的培養(yǎng)基中，檢測轉(zhuǎn)化子抗性的遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果顯示穩(wěn)定性達(dá)到100％。
　　 檢測了403個日本曲霉轉(zhuǎn)化子的甘油氧化酶產(chǎn)量情況，發(fā)酵培養(yǎng)基為甘油4％，胰蛋白胨0.1％，MgSO40.1％，KH2PO4 0.1％，玉米漿0.2％，酵母膏0.6％，培養(yǎng)條件為180r/min，30℃， 48小時。篩選得到了一株酶產(chǎn)量

6、提高50％的突變株Ajyz0079，其酶產(chǎn)量為2.08U/ml。
　　 通過收集菌體，液氮研磨，硫酸銨鹽析，Sephadex G-25凝膠過濾，瓊葡糖凝膠G-200 FF凝膠過濾層析對日本曲霉生產(chǎn)的甘油氧化酶進(jìn)行了分離純化，并通過Native—PAGE和SDS—PAGE確定其由8個分子量約為54.9KDa的亞基組成。
　　 甘油氧化酶在以甘油為底物時，最適作用溫度為37℃，最適pH為6.5。其Km值為8.95mmol/L