根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)產(chǎn)甘油假絲酵母轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、甘油是一種重要的輕化工原料，已廣泛應(yīng)用于化妝品、牙膏、煙草、香精、水性油墨、印染紡織、涂料、合成樹脂、皮革、造紙、制藥、食品和國防等十多個領(lǐng)域的1700多種產(chǎn)品。耐高滲酵母——產(chǎn)甘油假絲酵母是本研究室擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的甘油生產(chǎn)菌株，其發(fā)酵生產(chǎn)甘油具有高產(chǎn)量、高轉(zhuǎn)化率和高回收率等優(yōu)點(diǎn)，在我國得到了較好的工業(yè)化應(yīng)用。近些年來，利用基因工程菌生產(chǎn)甘油越來越引起人們的關(guān)注。采用基因工程手段構(gòu)建重組菌可以對產(chǎn)甘油假絲酵母代謝途徑進(jìn)行有目的的改造，

2、進(jìn)一步改進(jìn)產(chǎn)甘油假絲酵母的性能，以達(dá)到提高甘油產(chǎn)量和改善工藝的目的。實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)首先要獲得有效的轉(zhuǎn)化方法。 本研究首先通過構(gòu)建質(zhì)粒pCAM3300-URA3將其轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌。利用URA3基因缺陷互補(bǔ)為篩選標(biāo)記，嘗試采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化釀酒酵母，取得了成功。 在轉(zhuǎn)化釀酒酵母成功的基礎(chǔ)上，本研究通過構(gòu)建質(zhì)粒pCAM3300-Zeocin，將其電擊轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌。通過將含有目的質(zhì)粒pCAM3300-Zeocin的根癌

3、農(nóng)桿菌和產(chǎn)甘油假絲酵母共培養(yǎng)，利用Zeocin抗性基因?yàn)楹Y選標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)了pCAM3300-Zeocin對產(chǎn)甘油假絲酵母的轉(zhuǎn)化。在研究中根據(jù)根癌農(nóng)桿菌的生長特性，對轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化，在共培養(yǎng)時間為24h，細(xì)胞比例為1：500-1000時最高轉(zhuǎn)化率達(dá)到2個轉(zhuǎn)化子/104個酵母細(xì)胞。初步建立了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化產(chǎn)甘油假絲酵母的轉(zhuǎn)化方法為進(jìn)一步研究產(chǎn)甘油假絲酵母打下基礎(chǔ)。 利用PCR技術(shù)從釀酒酵母中擴(kuò)增其全長產(chǎn)甘油關(guān)鍵酶3-磷酸甘油脫

4、氫酶基因(GPD1)，構(gòu)建質(zhì)粒pCAM3300-Zeocin-GPD1并將其轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌。首次利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)將釀酒酵母GPD1全長基因轉(zhuǎn)入產(chǎn)甘油假絲酵母，在zeocin抗性平皿上挑取陽性轉(zhuǎn)化子。對得到的陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選，得到一株在含有玉米漿5g/L、尿素2g/L、葡萄糖250g/L的培養(yǎng)基中30℃、200r/min的條件下發(fā)酵80h甘油產(chǎn)量可提高12.93％的轉(zhuǎn)化子，將其命名為Candidaglycerinogenes-

5、GPD1-10(C.g-G10)。C.g-G10在菌體生長平衡期甘油積累速率比C.g提高了71.7％，Gpdlp酶活力提高了22.33％；伴隨甘油積累速率和Gpdlp酶活力的提高，C.g-G10耗糖速率相比提高了36.92％，發(fā)酵時間縮短了將近24h。這說明通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化GPD1全長基因轉(zhuǎn)入產(chǎn)甘油假絲酵母并進(jìn)行了有效的表達(dá)。研究表明GPD1全長基因的插入并沒有改變C.g-G10的菌體生長過程和對磷源的適應(yīng)性狀。 對C.g