產(chǎn)甘油假絲酵母產(chǎn)甘油發(fā)酵的代謝機理.pdf

1、甘油是一種重要的輕化工原料，已廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥、食品和國防等十多個領(lǐng)域的1700多種產(chǎn)品。近些年來，利用耐高滲酵母生產(chǎn)甘油越來越引起人們的關(guān)注。耐高滲酵母——產(chǎn)甘油假絲酵母是本研究室擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的甘油生產(chǎn)菌株，其發(fā)酵生產(chǎn)甘油具有高產(chǎn)量、高轉(zhuǎn)化率和高回收率等優(yōu)點，在我國得到了較好的工業(yè)化應(yīng)用。但是，迄今為止，我們對其遺傳背景依然知之甚少，更沒有從細胞全局性水平的高度對其復雜代謝網(wǎng)絡(luò)中各代謝途徑之間的關(guān)系做深入透徹的研究，而這些方面

2、的知識只是更多地借鑒了釀酒酵母等其它酵母的有關(guān)研究成果。 本文根據(jù)微生物代謝及其調(diào)控理論研究產(chǎn)甘油假絲酵母產(chǎn)甘油發(fā)酵的代謝機理，探討其甘油合成途徑與EMP途徑、HMP途徑和TCA循環(huán)之間的內(nèi)在聯(lián)系，以此闡明產(chǎn)甘油假絲酵母高產(chǎn)甘油的內(nèi)在本質(zhì)，并為將來對甘油合成及其下游產(chǎn)品(如1，3-丙二醇)的代謝工程研究打下基礎(chǔ)?，F(xiàn)將取得的主要研究成果歸納如下： 1.以復合培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基進行比較發(fā)酵，研究了玉米漿及其主要成分在產(chǎn)甘油假

3、絲酵母產(chǎn)甘油發(fā)酵過程中的作用機理。結(jié)果表明：用復合培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)甘油時，玉米漿用量決定了發(fā)酵過程中菌體生長、甘油合成和葡萄糖消耗的情況，其濃度的較小變化即可引起發(fā)酵過程和結(jié)果的顯著變化。玉米漿磷可以調(diào)節(jié)EMP途徑與HMP途徑之間葡萄糖代謝流的分布；隨著玉米漿磷濃度的增加，HMP途徑被抑制而EMP途徑被激活，結(jié)果細胞生物量增加。玉米漿氮也可作為氮源被利用，但它并不是產(chǎn)甘油假絲酵母的適宜氮源。玉米漿中的微量元素能夠顯著提高葡萄糖的消耗速率、

4、促進菌體生長和提高甘油產(chǎn)量。 2.對不同發(fā)酵階段用于菌體生長、代謝維持、甘油合成和副產(chǎn)物形成所消耗的葡萄糖進行了動力學分析。當玉米漿作磷源時，生長動力學參數(shù)Xm隨玉米漿濃度增加而線性遞增，且發(fā)酵過程中甘油合成與菌體生長耦聯(lián)緊密；當KH2PO4濃度在0.49-0.73g/L范圍內(nèi)時，Xm、μm基本恒定，甘油合成與菌體生長相關(guān)性較小。隨著培養(yǎng)基中磷濃度增高，整個發(fā)酵過程中用于菌體產(chǎn)生和維持代謝所消耗的葡萄糖基本保持穩(wěn)定，而在快速生長

5、階段兩者之和呈遞增趨勢；但是無論在哪個階段，用于甘油合成所消耗的葡萄糖先隨磷濃度升高而增加然后逐漸減少。副產(chǎn)物的形成主要發(fā)生在快速生長階段，而穩(wěn)定期生成的副產(chǎn)物很少。當玉米漿濃度為14g/L、KH2PO4濃度為0.57g/L時，整個發(fā)酵過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物最少，分別為5.8％和4.3％；甘油對葡萄糖得率最高，分別達到0.534g/g和0.528g/g。 3.在28-36℃范圍內(nèi)，由于發(fā)酵周期隨溫度升高而顯著縮短，導致細胞生長、甘油

6、合成和葡萄糖消耗的比速率也隨溫度升高逐漸增加。但是，當溫度為32℃時最適于產(chǎn)甘油假絲酵母合成甘油，甘油產(chǎn)量、得率和產(chǎn)率分別達到120.3g/L、0.523g/g、1.43g/(L·h)。應(yīng)用Logistic、Luedeking-Piret和Luedeking-Piret-Like方程分別對細胞生長動力學、甘油合成動力學和葡萄糖消耗動力學進行了模擬，獲得不同溫度下的各種動力學參數(shù)。根據(jù)細胞生長動力學參數(shù)，得到28-36℃范圍內(nèi)甘油分批發(fā)酵

7、過程中細胞濃度同溫度及底物濃度之間的一般關(guān)系式：X(t)=35.89(T-11.7)2exp[1.32×10-4(T+6.339)2t-2037./(T+273.13)]/1.38×104exp[-2037.3(T+273.13)]+2.61×10-3(T-11.7)2{exp[1.32×10-4(T+6.339)2t]-1}驗證實驗表明，該模型在28-36℃范圍內(nèi)可用于預(yù)測不同溫度下的細胞生長情況。 4.當溶氧濃度為10％時，

8、發(fā)酵過程呈現(xiàn)出“巴斯德效應(yīng)”的特征，生成的酵解代謝副產(chǎn)物維持在較高水平。在快速生長階段，隨著溶氧從10％增加到60％，細胞呼吸類型由厭氧呼吸向好氧呼吸轉(zhuǎn)變，酵解代謝副產(chǎn)物依次減少。在生長穩(wěn)定期，菌體耗氧量急劇下降，此階段改變?nèi)苎跛娇梢哉{(diào)節(jié)EMP途徑、HMP途徑和TCA循環(huán)之間葡萄糖代謝流的合理分配：當溶氧控制在30％時，葡萄糖代謝流由EMP途徑向HMP途徑發(fā)生遷移，從而導致甘油合成途徑的代謝流增加，甘油產(chǎn)量、得率和產(chǎn)率達到最高，分別為

9、120.7g/L、0.575g/g和1.69g/(L·h)；當溶氧濃度為60％時，TCA循環(huán)可能因參與線粒體電子傳遞鏈的酶受到高濃度氧的毒害而導致其代謝通量減少，而葡萄糖代謝流則由HMP途徑向EMP途徑發(fā)生遷移，EMP途徑“溢流”壓力增加，糖酵解代謝副產(chǎn)物增多。 5.以EMP途徑與TCA循環(huán)中間代謝物添加作對照，確定了氨基酸的作用類型，以及具有強促進作用氨基酸的作用濃度和添加時機；在適宜條件下添加L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-天

10、冬氨酸、L-天冬酰胺、L-甘氨酸、L-賴氨酸、L-酪氨酸、L-脯氨酸、L-組氨酸和L-絲氨酸等第一類氨基酸，甘油產(chǎn)量均呈顯著增加趨勢，甘油得率和增產(chǎn)率分別達到0.60g/g和16％以上。 6.在產(chǎn)甘油假絲酵母產(chǎn)甘油發(fā)酵過程中，添加第一類氨基酸可以提高HMP途徑、TCA循環(huán)和甘油合成途徑關(guān)鍵酶G6PDH、CIT與ctGPD的活性，而EMP途徑關(guān)鍵酶PYK的活性降低。因此，第一類氨基酸促進甘油合成的作用機理為：第一類氨基酸添加后分解

11、成相應(yīng)酮酸進入TCA循環(huán)從而導致其代謝流增加，由EMP途徑下行至TCA循環(huán)的代謝通量減少；同時，HMP途徑代謝流急劇增加，必須通過促進甘油合成來緩解其“溢流”壓力。 7.對發(fā)酵罐水平添加L-甘氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺、丙酮酸和α-酮戊二酸等物質(zhì)的甘油分批發(fā)酵過程進行了動力學分析。結(jié)果表明，L-甘氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺、丙酮酸和α-酮戊二酸等物質(zhì)的添加能使葡萄糖消耗速率加快、發(fā)酵周期縮短、甘油得率提高，甘油產(chǎn)率分別達

12、到1.66g/(L·h)、1.59g/(L·h)、1.61g/(L·h)、1.54g/(L·h)和1.68g/(L·h)，分別比對照提高了25.2％、19.2％、20.8％、15.9％和26.3％；副產(chǎn)物形成主要發(fā)生在快速生長階段，而甘油產(chǎn)量的顯著提高則主要發(fā)生在穩(wěn)定生長期。 8.細胞內(nèi)PolyP的積累不僅與滲透壓有關(guān)，也與培養(yǎng)基中磷酸鹽含量有關(guān)。當培養(yǎng)基中磷酸鹽含量相同時，滲透壓越高胞內(nèi)積累的PolyP越多；當滲透壓相同時，培

13、養(yǎng)基中磷酸鹽含量越高胞內(nèi)PolyP的積累量也越大。當細胞由貧磷條件轉(zhuǎn)接入富磷條件下培養(yǎng)時，胞內(nèi)PolyP積累量急劇增加。特別地，胞內(nèi)積累的PolyP可以提高產(chǎn)甘油假絲酵母對強酸性脅迫的耐受力，從而增加細胞在穩(wěn)定生長期的存活率。 9.在產(chǎn)甘油假絲酵母發(fā)酵產(chǎn)甘油過程中，富磷可以抑制HMP途徑而激活EMP途徑，糖酵解代謝加劇，因而TCA循環(huán)和甘油合成途徑的代謝流減少，甘油產(chǎn)量下降。但是，無論富磷培養(yǎng)基還是適磷培養(yǎng)基，在一定范圍內(nèi)增加其

14、滲透壓，PYK活性受到抑制，而G6PDH、CIT和ctGPD活性都增強，甘油產(chǎn)量提高。但是，對最高甘油產(chǎn)量而言，富磷和適磷培養(yǎng)條件均存在一個最適滲透壓。 10.當細胞從適磷培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接入貧磷培養(yǎng)基時甘油的產(chǎn)量最高，在第14h和第38h轉(zhuǎn)接時，甘油得率分別高達0.609g/g和0.614g/g，而甘油產(chǎn)率則分別為2.03g/(L·h)和2.23g/(L·h)。這為產(chǎn)甘油假絲酵母反復分批發(fā)酵法生產(chǎn)甘油提供了重要依據(jù)，同時也說明限制發(fā)酵

15、培養(yǎng)基中磷源的濃度是其高產(chǎn)甘油的必要條件。 11.反復分批發(fā)酵過程中細胞回用條件為：第一級發(fā)酵的培養(yǎng)基為適磷培養(yǎng)基(KH2PO4濃度為0.4g/L)，回用培養(yǎng)基為貧磷培養(yǎng)基(KH2PO4濃度為0.1g/L)，當上一批次發(fā)酵液中葡萄糖濃度降至10g/L以下時，將酵母細胞無菌離心后不經(jīng)洗滌全部轉(zhuǎn)接入貧磷培養(yǎng)基中繼續(xù)下一批次的發(fā)酵。在合成培養(yǎng)基中，經(jīng)過15個細胞回用周期，甘油的平均產(chǎn)量、平均得率和平均產(chǎn)率分別達到138.7g/L、0.

16、602g/g和2.31g/(L·h)，分別增加了15.7％、15.5％和39.2％；由于回用到第15次時細胞嚴重衰退，細胞回用周期以12-14次為好。類似地，在復合培養(yǎng)基中，當細胞回用9個批次時，甘油的平均產(chǎn)量、平均得率和平均產(chǎn)率分別為145.0g/L、0.609g/g和2.42g/(L·h)，分別增加了14.5％、15.3％和37.3％；細胞以回用9次為宜。 12.與傳統(tǒng)分批發(fā)酵相比，產(chǎn)甘油假絲酵母細胞多次回用的反復分批發(fā)酵具