產(chǎn)朊假絲酵母尿酸酶熱失活機(jī)制的研究.pdf

1、尿酸酶是治療高尿酸血癥的藥用酶和測(cè)定血清尿酸的工具酶，需提高其活性和熱穩(wěn)定性。天然產(chǎn)朊假絲酵母菌(C.G.M.C.C.2.1008)尿酸酶有優(yōu)良熱穩(wěn)定性；本文分析其熱失活過程解釋其機(jī)制。本研究分為三個(gè)部分：
　　⑴產(chǎn)朊假絲酵母尿酸酶熱失活曲線的表征。產(chǎn)朊假絲酵母尿菌株(C.G.M.C.C.2.1008)擴(kuò)大培養(yǎng)后，經(jīng)尿酸誘導(dǎo)，表達(dá)尿酸酶。離心收集菌體，超聲裂解，離心收集上清粗酶液，經(jīng)DEAE-cellulose52纖維素柱純化，采

2、用負(fù)吸附的方法，收集穿透液，經(jīng)PEG-20000濃縮，透析過夜。酶粗品經(jīng)上述步驟純化2次，得到尿酸酶純品，SDS-PAGE表征其純度，比活為10.0 kU g-1。樣品經(jīng)中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院蛋白質(zhì)組學(xué)研究分析中心分析證明：1）蛋白質(zhì)樣品純度為93.26％。2）肽鏈分子質(zhì)量17.35 kD。3）MALDI–TOF/TOF分析證實(shí)其氨基酸序列類似于FAD依賴性吡啶核苷酸-二硫化物氧化還原酶(gi|154253900)。4）N端封閉而

3、未能有效進(jìn)行Edman降解測(cè)定其N端氨基酸序列。酶蛋白保存體系，含抗生素，對(duì)氨基苯甲脒，EDTA，PMSF，小分子抑制劑類配體及濃縮蛋白樣品，在37℃不同 pH條件下保存。間隔一定時(shí)間取樣測(cè)定酶活性以記錄其衰減過程。發(fā)現(xiàn)該尿酸酶的熱失活過程分為顯著的兩個(gè)階段：前一階段其活性保持在一個(gè)平臺(tái)期（活性的下降不超過初始活性的10%），而后一階段尿酸酶的活性呈類似指數(shù)衰減至30%以下，平臺(tái)期后活性衰減一半的時(shí)間段稱為半衰期，這種特殊的熱失活現(xiàn)象稱

4、為平臺(tái)期效應(yīng)。在pH=7.4條件下，平臺(tái)期為4天，加入小分子抑制劑氧嗪酸鉀，平臺(tái)期增加至23天；在pH=9.2條件下，平臺(tái)期為12天，加入氧嗪酸鉀，平臺(tái)期延長至24天。
　?、飘a(chǎn)朊假絲酵母尿酸酶熱失活模型的建立與分析。公認(rèn)尿酸酶活性結(jié)構(gòu)形式為4個(gè)相同的單體聚合而成的四聚體。熱失活后的該假絲酵母尿酸酶樣品經(jīng)SDS–PAGE及酸性PAGE分析，發(fā)現(xiàn)大量四聚體解聚為二聚體和單體，而可溶性總蛋白量并未明顯減少，說明尿酸酶熱失活的原因可能是

5、由于寡聚體的解聚而非蛋白質(zhì)的降解。在含配體的保存體系中，四聚體減少的速度降低。在尿酸酶熱失活過程中，同四聚體與同二聚體間有多對(duì)非共價(jià)相互作用，在同四聚體解聚至兩個(gè)非變性同二聚體之前，存在多個(gè)構(gòu)象中間體。設(shè)最弱非共價(jià)相互作用的斷裂與再形成為基元反應(yīng)。假定在熱失活過程中，多個(gè)更強(qiáng)非共價(jià)相互作用的動(dòng)力學(xué)及熱力學(xué)的貢獻(xiàn)都可用多個(gè)基元反應(yīng)的累積貢獻(xiàn)而代替?；谝陨霞僭O(shè)建立如下動(dòng)力學(xué)模型：含有n個(gè)四聚體形態(tài)系列中間體定義為Tm(其下標(biāo)m表示所含維持

6、四聚體結(jié)構(gòu)的基元反應(yīng)數(shù)量)；Tm相互之間的差異僅在基元反應(yīng)數(shù)量；它們相互之間保持可逆動(dòng)態(tài)平衡；僅含一個(gè)基元反應(yīng)的四聚體狀態(tài)中間體最終可逆性轉(zhuǎn)化為非變性二聚體HD，而HD將進(jìn)一步不可逆轉(zhuǎn)化為變性的二聚體DD。將所涉及基元反應(yīng)的兩個(gè)方向及其它各轉(zhuǎn)化速率常數(shù)設(shè)為參數(shù)，將四聚體總濃度歸一化；通過迭代數(shù)值積分計(jì)算給定參數(shù)組合所對(duì)應(yīng)的尿酸酶的熱失活曲線，用于最小二乘擬合（LSF）實(shí)驗(yàn)測(cè)定的熱失活曲線，獲得所需參數(shù)組合。通過Matlab軟件分析熱失活

7、曲線，發(fā)現(xiàn)參數(shù)之間有嚴(yán)重的協(xié)方差；其中基元反應(yīng)斷裂的速度常數(shù)(k1)最關(guān)鍵。為消除參數(shù)之間的協(xié)方差，將k1設(shè)定為常數(shù)再擬合熱失活曲線且k1滿足如下要求：(a)以0.0001為速度常數(shù)下限；優(yōu)化k1使所有其它速度常數(shù)都大于0.001/min；(b)使m盡量小以降低計(jì)算量；（3）使得其他參數(shù)能夠關(guān)聯(lián)以便比較。據(jù)此擬合熱失活曲線結(jié)果表明：無氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的條件下，在pH7.4時(shí)m=24，在pH9.2時(shí)m=64；在氧嗪酸鉀誘導(dǎo)條件下，在pH7.4

8、時(shí)m=80，在pH9.2時(shí)m=140。進(jìn)一步分析各種條件下平臺(tái)期長短及所得基元反應(yīng)逆反應(yīng)速度常數(shù)(k-1)、非變性二聚體再聚合成四聚體的速度常數(shù) k-2及非變性二聚體變性速度常數(shù) k2表明，此真菌尿酸酶活性指數(shù)下降之前的平臺(tái)期由m決定，而非k_2與k_1或k2；氧嗪酸鉀與此尿酸酶的結(jié)合可能導(dǎo)致其構(gòu)象變化，大大增加同二聚體之間的相互作用而提高四聚體穩(wěn)定性，并同時(shí)減少同二聚體的變性速度和再聚合成四聚體的速度。此尿酸酶熱失活平臺(tái)期長短和指數(shù)衰

9、減部分的半衰期不是尿酸酶同四聚體解離的熱力學(xué)，而是其解聚動(dòng)力學(xué)決定的。
　　⑶熱失活動(dòng)力學(xué)模型的應(yīng)用。以熱失活動(dòng)力學(xué)模型為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)了苛求芽孢桿菌尿酸酶突變體，將291位E-R離子鍵破壞，成功表達(dá)純化了突變體E291Q。與野生型尿酸酶熱穩(wěn)定相比，E291Q在不同pH條件下和氧嗪酸鉀配體誘導(dǎo)條件下，熱穩(wěn)定性均有所減弱。E291Q在無配體誘導(dǎo)條件下，無平臺(tái)期，加入配體氧嗪酸鉀，觀察到明顯的平臺(tái)期，熱穩(wěn)定性明顯恢復(fù)，但仍未達(dá)到野生型的熱

10、穩(wěn)定性，說明離子鍵的破壞對(duì)其熱穩(wěn)定性的降低有明顯作用。電泳結(jié)果顯示，E291Q系統(tǒng)中四聚體和二聚體均有存在，且二聚體條帶中顯示出催化活性，可能在染色過程中其同二聚體在底物誘導(dǎo)下，重新組配成四聚體。以前文建立的尿酸酶動(dòng)力學(xué)模型分析E291Q的熱失活過程，發(fā)現(xiàn)該模型能很好地?cái)M合其熱失活曲線。模型參數(shù)分析顯示，結(jié)合了氧嗪酸鉀分子后，尿酸酶同四聚體中間體數(shù)目明顯增加，說明配體的結(jié)合使尿酸酶四聚體內(nèi)部的相互作用力明顯增加；動(dòng)力學(xué)參數(shù)顯示，E291

11、Q在無氧嗪酸鉀結(jié)合的條件下，同四聚體間轉(zhuǎn)化的速率常數(shù)很高，同四聚體的穩(wěn)定性差，而在結(jié)合了底物之后，大量的非變性同二聚體又迅速組配成同四聚體，解釋了電泳圖中二聚體條帶存在的原因。小分子配體的結(jié)合增加了四聚體內(nèi)部相互作用的基元反應(yīng)數(shù)量，大大延長了四聚體解聚的動(dòng)力學(xué)過程，延緩其熱失活而出現(xiàn)平臺(tái)期。同時(shí)推測(cè)，尿酸酶中離子鍵的破壞將涉及尿酸酶表面整體靜電網(wǎng)絡(luò)的破壞，這種破壞在一定程度上通過pH效應(yīng)及配體誘導(dǎo)效應(yīng)恢復(fù)，但無法達(dá)到最好的狀態(tài)。尿酸酶熱