產(chǎn)朊假絲酵母生產(chǎn)谷胱甘肽過程控制與優(yōu)化.pdf

1、谷胱甘肽(GSH)作為一種具有γ-谷氨?；蛶€基的生物活性三肽，是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸縮合而成。GSH可清除胞內(nèi)超氧物因離子和自由基，保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，具有抗脂質(zhì)氧化作用，使細(xì)胞免受傷害，從而維持細(xì)胞正常代謝。因而，GSH在食品、醫(yī)藥、保健、抗衰老方面的應(yīng)用日益廣泛。
　　 與其他生產(chǎn)GSH的方法(活性組織提取、化學(xué)合成和酶轉(zhuǎn)化法)相比較，微生物發(fā)酵法是目前GSH工業(yè)化生產(chǎn)的最普遍方法之一。本論文以一株高積累GSH的產(chǎn)朊

2、假絲酵母(Candida utilis WSH02-08)為出發(fā)菌株，以實(shí)現(xiàn)GSH發(fā)酵高產(chǎn)量、高得率和高生產(chǎn)強(qiáng)度為目標(biāo)，采用增加細(xì)胞密度(流加培養(yǎng))、提高胞內(nèi)GSH含量(前體氨基酸添加、ATP再生)以及環(huán)境脅迫等一系列技術(shù)與策略，對GSH發(fā)酵過程進(jìn)行優(yōu)化控制，主要研究內(nèi)容如下：
　　 (1)考察了分批培養(yǎng)、指數(shù)速率流加和恒速流加對細(xì)胞生長和GSH合成的影響，并提出了三階段(分批培養(yǎng)、指數(shù)速率流加和恒速流加)細(xì)胞高密度培養(yǎng)策略。分

3、批培養(yǎng)時初糖(葡萄糖)濃度為15 g/L，發(fā)酵9h時葡萄糖消耗完畢，經(jīng)過12h指數(shù)速率流加(比生長速率為0.2 h-1)，和24 h恒數(shù)流加(補(bǔ)糖速度為5.5 g/L/h)，發(fā)酵培養(yǎng)45 h后，細(xì)胞密度達(dá)102 g/L，GSH濃度為981 mg/L。
　　 (2)在細(xì)胞高密度培養(yǎng)基礎(chǔ)上，考察了半胱氨酸添加對GSH合成的影響，一次性添加半胱氨酸為50 mmol/L時，GSH產(chǎn)量達(dá)最大值1534 mg/L；由于胞內(nèi)GSH的大量積累會

4、對谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSHI)活性產(chǎn)生反饋抑制作用，因而進(jìn)一步考察低pH脅迫與半胱氨酸添加相結(jié)合對GSH合成的影響，將50 mmol/L半胱氨酸分兩次(每次25mmol/L)添加并與低pH脅迫結(jié)合促進(jìn)GSH合成，最終GSH總產(chǎn)量達(dá)1825 mg/L。
　　 (3)當(dāng)半胱氨酸添加量為50 mmol/L時，發(fā)現(xiàn)用于GSH合成的半胱氨酸僅為其添加量的4%，為此，考察了溶氧對半胱氨酸吸收和GSH合成的影響，并提出了兩階段溶氧水平控制

5、與半胱氨酸添加相結(jié)合的策略來促進(jìn)GSH合成，結(jié)果半胱氨酸的添加量由50 mmol/L減少到30 mmol/L；添加量降低了40%，而GSH產(chǎn)量卻達(dá)到1734 mg/L，比對照提高了13%。最后將pH脅迫和溶氧控制同時與半胱氨酸添加(添加濃度為30 mmol/L)相組合，通過低pH脅迫和兩階段溶氧控制，GSH終產(chǎn)量達(dá)1936 mg/L.比對照提高了26%。
　　 (4)研究搖瓶條件下細(xì)胞生長階段谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸三種氨基酸對

6、細(xì)胞生長和GSH合成的影響，與添加谷氨酸和半胱氨酸相比，添加甘氨酸對細(xì)胞生長和GSH合成均有促進(jìn)作用，當(dāng)2h時添加6mmol/L甘氨酸，發(fā)酵到第10 h時，細(xì)胞密度和GSH產(chǎn)量達(dá)10.41 g/L和125 mg/L，分別比對照提高了10.1%和34.1%。
　　 (5)細(xì)胞停止生長后，加入三種氨基酸，并通過Central-Composite實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到三種氨基酸最佳濃度配比(谷氨酸6 mmol/L、甘氨酸5.5 mmol/L、半

7、胱氨酸6.5mmol/L)，經(jīng)過30 h培養(yǎng)，GSH總產(chǎn)量達(dá)278mg/L。兩階段氨基酸添加使細(xì)胞干重和GSH產(chǎn)量達(dá)到10.4 g/L和278 mg/L，將此策略應(yīng)用于7L罐上，細(xì)胞干重和GSH產(chǎn)量分別為12.81g/L和328 mg/L，進(jìn)一步將兩階段氨基酸添加策略與細(xì)胞高密度培養(yǎng)相結(jié)合時，最終GSH產(chǎn)量可高達(dá)1952 mg/L，胞內(nèi)GSH含量為1.81%。
　　 (6)在兩階段氨基酸添加基礎(chǔ)上，考察了發(fā)酵后期胞內(nèi)前體氨基酸濃

8、度、ATP含量和GSHI活性變化，發(fā)現(xiàn)GSH停止合成的主要原因是由于ATP不足所致。通過添加ATP促進(jìn)GSH繼續(xù)合成，當(dāng)ATP添加量為3 g/L時，GSH總產(chǎn)量達(dá)2141mg/L:細(xì)胞進(jìn)一步經(jīng)SDS處理后，ATP添加量為2 g/L時，GSH總產(chǎn)量可達(dá)2153mg/L，而ATP用量則可減少33%；此外，通過補(bǔ)加葡萄糖和硫酸銨再生ATP促進(jìn)GSH合成，結(jié)果GSH總產(chǎn)量為2163 mg/L，與直接添加ATP相比，成本顯著下降，說明該策略具有很

9、好的實(shí)用性。
　　 (7)H2O2脅迫對GSH合成影響結(jié)果表明，H2O2可促進(jìn)GSH合成但同時又會抑制細(xì)胞生長，為此提出在細(xì)胞生長期添加低濃度H2O2和細(xì)胞停止生長時添加高濃度H2O2的H2O2多次(6h添加1mmol/L H2O2、8h添加2mmol/L H2O2、10 h添加4 mmol/L H2O2)脅迫策略，搖瓶分批發(fā)酵結(jié)束時(30 h)，GSH產(chǎn)量為188 mg/L，胞內(nèi)GSH含量達(dá)2.05%。將此策略應(yīng)用于7L罐上，

10、發(fā)酵30h時細(xì)胞干重和GSH產(chǎn)量分別為10.21g/L和258 mg/L，進(jìn)一步將此策略應(yīng)用于7L罐上和細(xì)胞高密度培養(yǎng)相結(jié)合，發(fā)酵結(jié)束(60 h)時，GSH產(chǎn)量高達(dá)1482 mg/L，胞內(nèi)GSH含量為1.52%，分別比對照提高了32%和38%。同時，H2O2脅迫使胞內(nèi)過氧化氫酶和GSH還原酶活性明顯增強(qiáng)，說明CAT和GSH直接參與了清除胞內(nèi)H2O2和其它活性氧離子。
　　 (8)對Na2SO4脅迫促進(jìn)GSH合成機(jī)理進(jìn)行初步探討，