二甲苯生物降解關(guān)鍵酶的原核表達和初步研究.pdf

1、目的：
　　 惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida MT-2)是一類由環(huán)境中分離得到對甲苯、二甲苯等芳香類化合物具有降解作用的微生物，其降解活性酶大部分由TOL質(zhì)粒的xyl基因簇表達，其中二甲苯單加氧酶(xylenemonooxygenase，XMO)和鄰苯二酚2、3雙加氧酶基因又是該降解途徑的關(guān)鍵酶和限速酶。所以本研究通過基因重組和蛋白原核表達技術(shù)，將外源的野生降解菌株惡臭假單胞菌(Pseudomonasputid

2、aMT-2)的二甲苯單加氧酶(xylenemonooxygenase，XMO)和鄰苯二酚2、3雙加氧酶基因重組到大腸桿菌BL21菌株中，并通過IPTG誘導(dǎo)表達得到相關(guān)酶蛋白，再運用相關(guān)酶活測定方法研究并驗證二甲苯單加氧酶和鄰苯二酚2、3雙加氧酶的功能。本研究為后續(xù)通過同源重組繼續(xù)導(dǎo)入降解途徑下游相關(guān)基因，構(gòu)建兼具安全性、穩(wěn)定性和徹底性的基因工程生物降解菌株進行了探索和奠定良好的基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 一、苯系化合物野

3、生降解菌株P(guān)seudomonasputidaMT-2的鑒定分析
　　 首先對從臺灣菌株保藏中心購買的PseudomonasputidaMT-2從兩個方面對菌株做了鑒定：(1)16srDNA鑒定：用細菌16SrDNA通用引物擴增出約1500bp的條帶，將該PCR產(chǎn)物與pMD19Tvector連接，構(gòu)建重組測序載體pMD19Tvector-16srDNA，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21菌株中，搖菌過夜，提取質(zhì)粒送大連寶生物工程有限公司測序

4、。(2)二甲苯降解能力的檢測，即在含不同濃度二甲苯的無機鹽培養(yǎng)基進行生長曲線繪制(OD600nm)（圖2）。無機鹽培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基)的配制為MgSO40.1g，CaCl2·2H2O0.02g，KH2PO40.68g，MnSO4·H2O0.03g，K2HPO41.73g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.03g，NH4NO41.0g，加蒸餾水定容至1000ml。
　　 二、二甲苯單加氧酶基因的克隆、表達與功能研究
　　 pET28

5、a+)-xylMA融合基因原核表達載體的構(gòu)建、表達與純化：
　　 二甲苯單加氧酶由兩個蛋白亞基組成，一個亞基為羥基化蛋白，一個亞基為電子傳遞蛋白，分別由xylM和xylA基因表達合成。利用PCR方法，以含二甲苯單加氧酶基因的PseudomonasputidaMT-2為模板，擴增基因xylM和xylA并將其分別亞克隆入原核表達載體pET28a(+)中，構(gòu)建成表達載體pET28a(+)-xylM和pET28a(+)-xylA，限制性

6、內(nèi)切酶雙酶切和測序鑒定質(zhì)粒構(gòu)建是否正確。將表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化EcoliBL21，IPTG誘導(dǎo)其表達，SDS-PAGE分析表達產(chǎn)物。將蛋白粗提取液通過鎳(Ni)柱親和層析分離純化目的蛋白，SDS-PAGE和WesternBlotting分析純化的蛋白，最后通過以還原性輔酶Ⅰ(NADH)和細胞色素c為底物的酶活分析來鑒定目的蛋白的活性。
　　 三、鄰苯二酚2、3雙加氧酶基因的克隆、表達與功能研究
　　 pET28a(+)-xylE

7、融合基因原核表達載體和pET28a(+)-xylE融合基因原核表達載體的構(gòu)建、表達與純化；
　　 利用PCR方法，以含xylE基因的PseudomonasputidaMT-2為模板，擴增基因xylE并將其亞克隆入原核表達載體pET28a(+)中，構(gòu)建成表達載體pET28a(+)-xylE，限制性內(nèi)切酶雙酶切和測序鑒定質(zhì)粒構(gòu)建是否正確。將表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化EcoliBL21，IPTG誘導(dǎo)其表達，SDS-PAGE分析表達產(chǎn)物。將蛋白粗提取

8、液通過鎳(Ni)柱親和層析分離純化目的蛋白，SDS-PAGE和WesternBlotting分析純化的蛋白，最后通過以鄰苯二酚為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基有氧培養(yǎng)和以鄰苯二酚為底物的酶活分析來鑒定目的蛋白的活性。
　　 結(jié)果：
　　 一、PseudomonasputidaMT-2的鑒定：
　　 (1)經(jīng)DNA測序得到一條長1499bp的16SrDNA序列，與GeneBank已提交的序列進行BLAST相似性搜索表明該微

9、生物應(yīng)歸屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)，并用DNAStar進行同源性分析并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，顯示與惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)同源性最近。(2)實驗結(jié)果看，所選惡臭假單胞菌可以利用二甲苯作唯一碳源實現(xiàn)穩(wěn)定增值，含有降解二甲苯的目的基因，可被用作實驗提取目的基因。
　　 二、二甲苯單加氧酶基因的克隆、表達與功能研究
　　 雙酶切及測序結(jié)果表明原核表達載體pET28a(+)-xylM和pET28

10、a(+)-xylA與設(shè)計相符。工程菌BL21/pET28(a+)-xylM和BL21/pET28(a+)-xylA誘導(dǎo)表達后分別可在35KD和40KD處產(chǎn)生特異性表達條帶，鎳柱親和層析后目的蛋白含量在80％以上，WesternBlotting結(jié)果顯示在35KD和40KD處有出現(xiàn)與目的蛋白相同大小的條帶。酶活測驗顯示XYLA蛋白具有較強的[H]電子傳遞的能力。
　　 三、鄰苯二酚2、3雙加氧酶基因的克隆、表達與功能研究
　　

11、 雙酶切及測序結(jié)果表明原核表達載體pET28a(+)-xylE與設(shè)計相符。工程菌BL21/pET28(a+)-xylE誘導(dǎo)表達后可分別在35KD產(chǎn)生特異性表達條帶。鎳柱親和層析后目的蛋白含量在90％以上，WesternBlotting結(jié)果顯示在35KD處有出現(xiàn)與目的蛋白相同大小的條帶。酶活分析顯示工程菌BL21/pET28(a+)-xylE能利用鄰苯二酚為唯一碳源生長，且鄰苯二酚2、3雙加氧酶能把鄰苯二酚降解為黃綠色的2-羥基-粘糠酸