皮膚組織生物力學(xué)和生物化學(xué)時(shí)序性變化推斷死亡時(shí)間.pdf

1、背景與目的：
　　死亡時(shí)間(Postmortem Interval,PMI)指從機(jī)體死亡至尸檢時(shí)的間隔時(shí)間。PMI的推斷可大致分為早期、晚期和白骨化推斷三個(gè)階段,由于存在諸多難以避免的人為及外界環(huán)境等因素的影響,死亡時(shí)間難以準(zhǔn)確推斷。準(zhǔn)確地推斷PMI,對(duì)于殺人案件的刑事偵查,及其他案件均具有重要的證據(jù)價(jià)值,推斷PMI至今仍是法醫(yī)鑒定工作的重點(diǎn)和難點(diǎn)問題。隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,推斷PMI的手段從早期主要依靠尸體現(xiàn)象,發(fā)展到現(xiàn)在

2、綜合利用生物物理學(xué)、生物化學(xué)、免疫組織化學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù)手段。但迄今,尚無公認(rèn)的準(zhǔn)確可靠、簡單易行的推斷PMI方法。
　　生物力學(xué)(biomechanics)是應(yīng)用力學(xué)原理和方法進(jìn)行生物組織力學(xué)方面定量研究的物理學(xué)分支,已在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛,形成了專門的醫(yī)學(xué)生物力學(xué),其在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用主要集中在機(jī)械性損傷的力學(xué)機(jī)制研究。尚未見應(yīng)用生物力學(xué)手段推斷死亡時(shí)間的系統(tǒng)研究。
　　本課題組前期基于尸體自溶腐敗過程中,組織的生物化

3、學(xué)降解必然導(dǎo)致其形態(tài)結(jié)構(gòu)改變,而組織結(jié)構(gòu)改變又必然導(dǎo)致其生物力學(xué)性狀改變的本構(gòu)關(guān)系或構(gòu)效關(guān)系原理,先后以大鼠和家豬軟組織為研究對(duì)象,初步證實(shí)了尸體組織器官生物力學(xué)性狀隨死亡時(shí)間延長的時(shí)序性變化和其推斷PMI的可行性。
　　本實(shí)驗(yàn)在課題組前期研究基礎(chǔ)上,同步應(yīng)用生物力學(xué)和生物化學(xué)的理論和技術(shù),探討了皮膚組織生物力學(xué)性狀和固定-萃取液生物化學(xué)物質(zhì)含量的時(shí)序性變化規(guī)律,及其與PMI的相關(guān)性。同時(shí),觀察皮膚組織大體形態(tài)、組織結(jié)構(gòu),應(yīng)用計(jì)算

4、機(jī)顯微病理圖像處理技術(shù),量化分析皮膚組織形態(tài)結(jié)構(gòu)與生物力學(xué)性狀變化的構(gòu)效關(guān)系,期望為法醫(yī)學(xué)推斷PMI提供新的理論依據(jù)和技術(shù)方法。
　　材料與方法：
　　1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物5頭4月齡閹割成年家豬(太湖豬種,汕頭屠宰場),平均體重150kg,常規(guī)主動(dòng)脈放血屠宰后,立即切取胸腹部平整區(qū)域的皮膚組織,放置25℃濕度70％±5%恒溫恒濕人工氣候箱保存。
　　2、取材規(guī)范時(shí)間組:從氣候箱保存時(shí)間算起,按0h、24h、48h、72h、96

5、、120h、144h、168h、192、216、240h、264h分12個(gè)時(shí)間組,5頭/組。
　　遵循“六定”原則:
　　①定時(shí)。按分組時(shí)間點(diǎn)取材,每頭家豬每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取4塊組織試件。
　?、诙ㄏ蚨ㄎ弧＝y(tǒng)一平行皮紋方向,切取5cm×1.5cm厚薄較均勻的矩形胸腹部皮膚組織樣本。
　　③定液定比。蒸餾水與甲醛原液9:1配制10%甲醛溶液固定液,試件質(zhì)量與固定液體積比1:10固定組織試件,密閉避光固定72h后取出組織試

6、件,進(jìn)一步處理等待上機(jī)測試。
　?、芏ㄐ巍Ｉ蠙C(jī)測試前,用游標(biāo)卡尺測量,將試件切成4cm×1cm標(biāo)準(zhǔn)試件,控制厚度3mm±0.5mm,福爾馬林浸濕紗布保濕,上機(jī)檢測。
　　3、組織形態(tài)學(xué)觀測
　?、糯篌w觀察和記錄各時(shí)間點(diǎn)的家豬皮膚組織的色澤、質(zhì)地、形態(tài)、氣味等變化情況。在自制固定光源照度箱內(nèi),采用數(shù)碼相機(jī)1400萬像素拍照皮膚表面照片,應(yīng)用Photoshop CS5讀取各樣本照片RGB值。
　?、茀⒖忌锪W(xué)性狀參

7、數(shù)選擇差異顯著的4個(gè)時(shí)間段內(nèi)0h,48h,72h,144h,168h,192h,216h,264h等8個(gè)時(shí)間組,備制皮膚組織石蠟切片,常規(guī)HE染色和膠原-網(wǎng)狀-彈力纖維三聯(lián)染色,使用Leica Application Suite Version 4.0.0圖像分析系統(tǒng),觀測各時(shí)間點(diǎn)的皮膚組織形態(tài)結(jié)構(gòu),并拍攝光鏡顯微組織照片,采用Image-Pro Plus 6.0病理圖像量化分析軟件,校準(zhǔn)標(biāo)尺空間后,特殊染色分析設(shè)定histogram

8、based\RGB(R門檻值為103,G門檻值為193,B門檻值均為211),20倍視野下,計(jì)算膠原纖維總面積、彈性纖維總面積、平均膠原纖維直徑,以及非膠原纖維總面積等指標(biāo)。
　　4、生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)
　　采用WDT-Ⅲ電子萬能材料試驗(yàn)機(jī),進(jìn)行拉伸測試,室溫下,20mm/min勻速單軸拉伸測試,測試前進(jìn)行10次預(yù)調(diào)試,預(yù)調(diào)間隔約30s。主要檢測記錄極限載荷、極限載荷變性,斷裂力、平均力等指標(biāo)。同時(shí),觀察試件大體形態(tài)變化。生物力學(xué)

9、實(shí)驗(yàn)完成后選取部分試件備制常規(guī)HE染色切片、膠原纖維染色,進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察,顯微圖像處理量化分析皮膚組織膠原、膠原纖維空隙面積等指標(biāo)。
　　5、生物化學(xué)檢測
　?、盘崛〗M織試件后,使用濾紙將組織固定-萃取液過濾到50mlEP管內(nèi),pH計(jì)檢測pH值;
　?、铺崛?.0ml上清液,5000轉(zhuǎn)離心處理后用紫外-可見光分光光度儀進(jìn)行色度檢測;
　　⑶提取上清液0.5ml,茚三酮染色后,用紫外-可見光分光光度儀檢測其蛋白

10、質(zhì)及其降解物含量。
　　6、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理
　　采用excel、SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,各組數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(`x±s)表示,采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)及單向方差分析(One-way ANONA),統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)的顯著性水平定義為:P<0.05為差異有顯著性。
　　結(jié)果：
　　1、形態(tài)學(xué)觀察
　?、湃庋鄞篌w觀察。隨PMI延長,各時(shí)間點(diǎn)皮膚組織顏色變化不明顯,質(zhì)地逐漸癱軟、液化;48h出現(xiàn)臭味,以

11、后逐漸明顯;96h開始可見皮表以毛孔為中心逐漸凹陷,隨時(shí)間延長凹陷逐漸擴(kuò)大,數(shù)目增多;216h組織自溶液化,部分組織全層溶解呈孔狀。
　?、平M織形態(tài)學(xué)及其顯微圖像量化分析。隨PMI延長,各時(shí)間點(diǎn)皮膚膠原纖維逐漸模糊、破碎、組織間隙擴(kuò)大;非膠原纖維總面積呈逐漸增大趨勢(shì),各時(shí)間點(diǎn)方差分析S-N-K法多重比較0h~48h,72h~144h,168h~192h,216h,264h等時(shí)間段與時(shí)間點(diǎn)相互之間差異顯著,P<0.05,推斷PMI窗

12、口期48h~264h,回歸方程:YNCFSA=232269XPMI+406884,R2=0.920。膠原纖維總面積,彈性纖維總面積和平均膠原纖維直徑個(gè)時(shí)間點(diǎn)無明顯差異,P>0.05,與PMI無相關(guān)性。
　　2、生物力學(xué)性狀
　　0h-264h,皮膚組織生物力學(xué)性狀參數(shù)呈整體階梯狀下降趨勢(shì),與PMI相關(guān)性明顯,極限載荷各時(shí)間組方差分析S-N-K法多重比較0h~48h,72h~144h,168h~192h,216h~264h等時(shí)

13、間段之間差異顯著,P<0.05,推斷PMI窗口期48h~216h,與PMI回歸方程:YML=-33.192XPMI+375.075R2=0.779;平均力方差分析S-N-K法多重比較0h~48h,72h~192h,216h~264h等時(shí)間段之間差異顯著P<0.05,推斷PMI窗口期48h~216h,與PMI的回歸方程:YAL=-13.628XPMI+167.121R2=0.653,極限載荷變形,斷裂力等各時(shí)間組相互比較P>0.05,PM

14、I無相關(guān)性。
　　3、組織固定-萃取液檢測
　?、牌つw組織固定-萃取液色度值5例家豬皮膚組織固定-萃取液色度值隨PMI延長呈階梯狀上升趨勢(shì),各時(shí)間組方差分析S-N-K法多重比較0h~48h,72h~120h,144h~264h等時(shí)間段之間差異顯著,P<0.05,推斷PMI窗口期48h~144h,直線回歸方程為:YChr=3.004XPMI-1.560R2=0.710。
　　⑵茚三酮染色5例家豬皮膚組織固定-萃取液茚三酮

15、染色后Abs570(±10)nm值隨PMI延長呈階梯狀上升趨勢(shì),各時(shí)間組差分析S-N-K法多重比較0h~24h,48h~120h,144h~216,240～264h等時(shí)間段差異顯著,推斷PMI窗口期24h~240h,直線回歸方程為:YAbs570(±10)nm=0.075XPMI-0.068R2=0.776。
　?、莗H值5例家豬皮膚組織固定-萃取液各時(shí)間組pH值無明顯差異,P>0.05。
　　結(jié)論：
　　1、水中家豬

16、皮膚組織極限載荷PMI延長呈時(shí)序性下降趨勢(shì),與PMI之間呈明顯的相關(guān)性,推斷PMI窗口期為48～216h,精確度達(dá)±24h,可作為一種推斷晚期水尸PMI的技術(shù)手段。
　　2、水中家豬皮膚組織固定-萃取液色度值和茚三酮反應(yīng)后Abs570(±10)nm值隨PMI延長呈上升趨勢(shì),其中色度值推斷PMI窗口期為48～144h,Abs570(±10)nm值為24～240h,精確度達(dá)±12h。
　　3、水中家豬皮膚組織非膠原纖維總面積隨P