惡臭假單胞菌KT2440中(p)ppGpp對(duì)生物被膜形成的調(diào)控作用.pdf

1、惡臭假單胞菌KT2440是環(huán)境微生物研究中的一株模式菌株，具有普遍認(rèn)可的生物安全性，多年來作為研究材料被用于研究有機(jī)污染物的生物降解、細(xì)菌的重金屬耐受性、細(xì)菌與植物互作以及細(xì)菌生物被膜和游動(dòng)性調(diào)控等。作為細(xì)菌的一種生存策略，形成生物被膜能有效提高細(xì)菌的物質(zhì)分解能力和抗逆能力，使細(xì)菌對(duì)多變的環(huán)境具有更強(qiáng)的適應(yīng)性，因此研究細(xì)菌生物被膜的調(diào)控模式對(duì)于理解細(xì)菌與環(huán)境的關(guān)系具有重要意義。(p)ppGpp是細(xì)菌用于響應(yīng)營養(yǎng)饑餓和部分環(huán)境刺激的信號(hào)分

2、子，在細(xì)胞中具有全局性的調(diào)控作用，對(duì)提高細(xì)菌在環(huán)境脅迫中的生存能力同樣起到關(guān)鍵性的作用。在多種病原微生物和腸道微生物中，(p)ppGpp對(duì)生物被膜的調(diào)控起著重要作用，但是在環(huán)境微生物中卻缺乏相關(guān)的報(bào)道。
　　本文研究了(p)ppGpp在KT2440生物形成過程中所發(fā)揮的作用以及胞外多糖Pea的功能和基因的表達(dá)調(diào)控，獲得以下結(jié)果:
　　1、KT2440中負(fù)責(zé)(p)ppGpp代謝的酶有兩個(gè)，分別是具有合成酶活性的RelA和既有弱

3、合成酶活性也有水解酶活性的SpoT。我們發(fā)現(xiàn)單獨(dú)缺失relA對(duì)KT2440的生物被膜表型不會(huì)造成明顯的影響，但是當(dāng)同時(shí)敲除relA和spoT，KT2440在固體表面上形成生物被膜的能力顯著增強(qiáng)，但是在氣液界面所形成的生物被膜卻變得松散脆弱，而且經(jīng)過長時(shí)間培養(yǎng)后，兩種生物被膜均不能正常消散。此外，relA-spoT突變體在蓋玻片上的粘附能力明顯增強(qiáng)，可是不能正常形成微菌落。
　　生物被膜形成過程中的粘附和發(fā)育以及生物被膜結(jié)構(gòu)的構(gòu)建均

4、與胞外基質(zhì)中的胞外多糖和粘附蛋白密切相關(guān)。首先通過對(duì)多聚糖的定量，我們發(fā)現(xiàn)relA突變體和relA-spoT突變體均能產(chǎn)生更多的多聚糖，雖然relA突變體和relA-spoT突變體的多聚糖總產(chǎn)量相似，但是只有relA-spoT突變體的菌斑變得光滑濕潤，因此造成菌斑形態(tài)變化的原因似乎不是多聚糖總產(chǎn)量的提高，而可能是不同的多糖產(chǎn)量發(fā)生改變。接著我們檢測(cè)了四個(gè)胞外多糖合成基因簇在突變體中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)alg表達(dá)水平未發(fā)生變化，peb和bcs

5、的表達(dá)量有一定程度的上升，但是pea的表達(dá)水平卻大幅下降，這些變化在relA-spoT突變體中均比在relA突變體中強(qiáng)烈，推測(cè)光滑菌斑的形成是由于缺乏Pea多糖。另外，檢測(cè)了粘附蛋白編碼基因lapA和lapF的表達(dá)水平后，發(fā)現(xiàn)lapA的表達(dá)顯著上升，而lapF呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)。根據(jù)已知的關(guān)于各個(gè)胞外多糖和粘附蛋白的功能，我們認(rèn)為lapA表達(dá)上升是relA-spoT突變體生物被膜增多和粘附能力增強(qiáng)的原因，LapF和Pea的不足可能導(dǎo)致了突變

6、體不能形成微菌落和液面生物被膜結(jié)構(gòu)的缺陷。為了更好地闡述(p)ppGpp對(duì)胞外基質(zhì)組分相關(guān)基因表達(dá)的影響，我們檢測(cè)了與之直接相關(guān)的調(diào)控因子的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)在relA-spoT突變體中fleQ的表達(dá)顯著上升，而rpoS則是顯著下降。在缺乏(p)ppGpp的情況下，σ因子RpoS的表達(dá)和功能發(fā)揮受抑制，導(dǎo)致lapF表達(dá)下降，同時(shí)促進(jìn)了轉(zhuǎn)錄上依賴σ因子RpoD的fleQ表達(dá)，表達(dá)量上升的FleQ促進(jìn)lapA的轉(zhuǎn)錄，雖然FleQ能抑制bcs的表

7、達(dá)，但是高水平c-di-GMP能解除這種抑制作用，促進(jìn)bcs表達(dá)。
　　2、有研究顯示Pea多糖與生物被膜的穩(wěn)定性和液面生物被膜的形成有關(guān)，但是pea的表達(dá)模式至今未被闡明。為了更好地解釋生物被膜表型和pea表達(dá)水平在relA-spoT突變體中的變化，我們探究了Pea的功能與基因的表達(dá)調(diào)控。我們發(fā)現(xiàn)pea基因簇從一個(gè)位點(diǎn)開始轉(zhuǎn)錄，該轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于基因簇首個(gè)基因的起始密碼子前面25bp，隨后發(fā)現(xiàn)pea的轉(zhuǎn)錄依賴于σ因子RpoS，推

8、測(cè)pea在relA-spoT突變體中的表達(dá)下降是RpoS的表達(dá)水平降低所致。在rpoS突變體中，另一個(gè)σ因子似乎也能介導(dǎo)pea轉(zhuǎn)錄，可是此時(shí)pea的轉(zhuǎn)錄水平非常低，根據(jù)點(diǎn)突變啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的結(jié)果，這個(gè)σ因子極可能是RpoD。生物被膜的檢測(cè)結(jié)果顯示，缺失pea雖然不影響生物被膜形成的初始階段，但在后續(xù)階段影響了生物被膜的發(fā)育，使生物被膜產(chǎn)量相對(duì)降低。另外，pea突變體完全喪失了形成液面生物被膜的能力，雖然lapF也是一個(gè)轉(zhuǎn)錄依賴于RpoS

9、的胞外基質(zhì)基因，但是lapF突變體的生物被膜表型與野生型菌株的相比沒有明顯差異，表明影響液面生物被膜形成的關(guān)鍵基質(zhì)成分是Pea而不是LapF，并且relA-spoT突變體氣液界面生物被膜的缺陷很可能是因?yàn)镻ea多糖在該突變體中的產(chǎn)量降低。Pea多糖還是形成由高水平c-di-GMP介導(dǎo)的褶皺菌斑的必要因素，含高水平c-di-GMP的rpoS突變體也能形成褶皺菌斑，但是比野生型菌株的明顯要弱，這可能是由于RpoD也能激活pea低水平的表達(dá)，