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文檔簡介
1、昆蟲體內(nèi)的生物胺,主要包括章魚胺(octopamine,OA)、酪胺(tyramine,TA)和多巴胺(dopamine,DA)等。它們在昆蟲體內(nèi)扮演著各種重要的生理角色,協(xié)同或各自調(diào)控著昆蟲的多種行為和生理過程,如影響昆蟲的產(chǎn)卵、晝夜節(jié)律、嗅覺、抉擇、相變、好斗和飛翔以及學(xué)習和記憶等。三者的合成底物都是氨基酸酪氨酸,且酪胺是章魚胺的合成前體。在昆蟲體內(nèi),它們主要是通過結(jié)合各自特異性的G蛋白偶聯(lián)受體來發(fā)揮作用。由于昆蟲體內(nèi)的生物胺受體一
2、直被視為殺蟲劑的潛在作用靶標,近年來,對昆蟲體內(nèi)生物胺,尤其是其對應(yīng)受體的藥理學(xué)性質(zhì)和生理學(xué)功能研究日益受到關(guān)注。有鑒于此,本研究以水稻生產(chǎn)上的重要害蟲二化螟Chilo suppressalis(鱗翅目Lepidoptera:草螟科Crambidae)為研究對象,采用分子生物學(xué)等手段對其體內(nèi)的章魚胺受體(octopamine receptors,OARs),酪胺受體(tyramine receptos,TARs)和多巴胺受體(dopam
3、ine receptors,DARs)的藥理學(xué)與生理學(xué)功能做了系統(tǒng)研究。
1.CsOA1受體調(diào)控細胞免疫的研究
本研究探索了章魚胺對昆蟲細胞免疫影響的分子機制(第二信使系統(tǒng))。章魚胺在低濃度時(<10-6 M)能夠提高二化螟幼蟲血細胞的延展和吞噬能力,然而在高濃度(>10-5 M)時卻抑制血細胞的延展和吞噬反應(yīng)。相應(yīng)的,章魚胺刺激血細胞能夠偶聯(lián)胞內(nèi)兩種不同的信號通路,鈣離子(Ca2+)和環(huán)腺苷酸(cAMP)。
4、在低濃度章魚胺刺激血細胞時,其僅能提高胞內(nèi)Ca2+濃度,而在高濃度章魚胺刺激血細胞時,其既能引起Ca2+上升,又能引起胞內(nèi)cAMP升高。我們在血細胞上克隆到1型章魚胺受體(CsOA1),通過原位雜交和免疫熒光等實驗技術(shù)確定其mRNA和受體蛋白表達于二化螟血細胞上。將其異源表達于HEK-293細胞后,與章魚胺對血細胞所引起的反應(yīng)類似,CsOA1也展示出了不同濃度章魚胺刺激可偶聯(lián)兩種信號通路的特性。因此,本實驗支持了以前的研究,章魚胺對昆蟲
5、先天免疫反應(yīng)的激活或抑制和其胞內(nèi)濃度有很大的關(guān)系。我們的結(jié)果也揭示出章魚胺很有可能是通過結(jié)合于血細胞膜上的CsOAl受體進而偶聯(lián)不同信號通路來發(fā)揮免疫功能的。生物應(yīng)激反應(yīng)時所產(chǎn)生的激素對其免疫系統(tǒng)有著復(fù)雜的作用,本研究所得的結(jié)果可為腎上腺素及其受體是如何參與調(diào)控脊椎動物免疫反應(yīng)的研究提供參考。
2.CsOA2B2受體的藥理學(xué)與生理學(xué)研究
從二化螟體內(nèi)克隆得到一類2型章魚胺受體(CsOA2B2),該基因與果蠅體
6、內(nèi)的CG6989(DmOA2B2)基因同源。表達譜分析表明,該基因主要表達于二化螟幼蟲神經(jīng)組織中。將其表達于HEK-293細胞后,在受到章魚胺刺激時,該受體能夠偶聯(lián)G。蛋白引起胞內(nèi)cAMP的上升,EC50值為2.33 nM,在章魚胺濃度為100 nM時所引起的cAMP反應(yīng)最大。藥理學(xué)實驗表明,激動劑中naphazoline特異性大于clonidine;拮抗劑中phentolamine,mianserin和chlorpromazine能夠
7、顯著拮抗章魚胺的激動效果。用這3種拮抗劑對二化螟幼蟲進行活體藥理學(xué)干擾后,進行行為測定的數(shù)據(jù)表明,經(jīng)mianserin和phentolamine處理的幼蟲運動能力顯著下降。
3.一種新型章魚胺受體CsOA3的功能研究
從二化螟體內(nèi)克隆得到一類孤兒受體,生物信息學(xué)分析表明其與果蠅體內(nèi)的CG18208基因同源,可能屬于生物胺受體家族成員。該基因通過可變剪切可產(chǎn)生兩個剪切體,CsOA3S和CsOA3L。CsOA3L
8、在內(nèi)膜3區(qū)處比CsOA3S多了30個氨基酸,該區(qū)域可能參與了受體與G蛋白的結(jié)合。為了研究其配體信息,偶聯(lián)的下游信號通路以及藥理學(xué)性質(zhì),我們分別將兩種剪切體真核表達于HEK-293細胞中。實驗表明,兩類受體均能引起胞內(nèi)Ca2+的上升,而CsOA3S受體還可被章魚胺激活引起胞內(nèi)cAMP的下降,酪胺雖也可激活此類受體但特異性沒有章魚胺高。藥理學(xué)實驗表明,CsOA3受體可被多種激動劑激活,包括有機氮類殺蟲劑殺蟲脒和雙甲脒等,而拮抗劑中唯有phe
9、ntolamine和epinastine具有顯著的拮抗效果。定量PCR實驗表明,該基因主要以短剪切體CsOA3S的形式出現(xiàn),并且廣泛表達于各類受測組織中,其中在神經(jīng)節(jié)和馬氏管中表達量最高。據(jù)我們所知,CsOA3是一類新型的章魚胺受體。
4.CsTyR1受體的藥理學(xué)研究
從二化螟內(nèi)獲得一個全長cDNA,序列分析表明,其為昆蟲TyR1受體家族,將其命名為CsTyR1。CsTyR1基因表達于各組織中,包括血細胞,脂
10、肪體,中腸,馬氏管,神經(jīng)節(jié)和表皮,而在神經(jīng)節(jié)中的表達量是其它組織的16-80倍。我們將構(gòu)建的CsTyR1真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于HEK-293細胞中,對其功能和藥理學(xué)特性做了系統(tǒng)研究。結(jié)果表明,酪胺和章魚胺能夠顯著降低forskolin誘導(dǎo)的cAMP含量,并且存在劑量效應(yīng)反應(yīng)(酪胺,EC50=369 nM;章魚胺,EC50=978 nM)。結(jié)果表明,該類受體主要是偶聯(lián)Gi蛋白引起胞內(nèi)cAMP的下降。在受測的激動劑中,CsTyR1可被cloni
11、dine和雙甲脒激活而不能被naphazoline和殺蟲脒激活。拮抗劑中,酪胺的作用可被10μtM的yohimbine,phentolamine和chlorpmmazine所阻斷。
5.CsTyR2受體的藥理學(xué)研究
克隆到編碼CsTyR2受體的基因全長,序列分析表明其與果蠅和家蠶體內(nèi)克隆到的2型酪胺受體同源。組織分布研究發(fā)現(xiàn),其主要表達于二化螟幼蟲的神經(jīng)節(jié)和馬氏管中。將該基因表達于HEK-293細胞所做的功能
12、試驗表明,其特異性的被酪胺激活后引起胞內(nèi)Ca2+的上升,EC50值約為20 nM。而另3種生物胺,章魚胺,多巴胺和5-羥色胺在10μM濃度下刺激該受體也未見有Ca2+反應(yīng),表明該類受體是特異性的酪胺受體,且偶聯(lián)Gq蛋白引起胞內(nèi)Ca2+上升。所測定的4種激動劑,雙甲脒、殺蟲脒、clonidine和naphazoline在10μM濃度下均不能有效刺激該受體,表明該類受體與之前的章魚胺和酪胺受體在藥理學(xué)上差異甚大。
6.D1-l
13、ike和D2-like多巴胺受體的藥理學(xué)研究
從二化螟體內(nèi)克隆得到3種多巴胺受體,分別命名為CsDOP1,CsDOP2和CsDOP3,其中CsDOP1和CsDOP3獲得了全長序列。序列分析表明,CsDOP1和CsDOP2屬于昆蟲D1-like受體家族,偶聯(lián)Gs蛋白引起胞內(nèi)cAMP的上升,CsDOP3屬于昆蟲D2-like受體家族,偶聯(lián)Gi蛋白引起胞內(nèi)cAMP的降低。將CsDOP1和CsDOP3受體分別表達于HEK-293細
14、胞后,對它們的藥理學(xué)性質(zhì)做了研究,多巴胺對兩受體的激活都有明顯的劑量效應(yīng)(CsDOP1,EC50=20 nM; CsDOP3,EC50=670 nM)。我們測定了一系列的激動劑和拮抗劑對CsDOP1和CsDOP3受體的影響。CsDOP1中,激動劑效能大小順序為6,7-ADTN>多巴胺>bromocriptine> pramipexole;而受測的拮抗劑中,有拮抗效果的拮抗劑,其效能大小順序為,SCH23390>butaclamol>ch
15、lorpromazine>phentolamine>yohimbine>propranolol>ketanserin> flupenthixol> mianserin; CsDOP3不但偶聯(lián)的信號通路與CsDOP1截然相反,它們之間的藥理學(xué)性質(zhì)也差異較大,激動劑bromocriptine(EC50=280 nM)的效能大于多巴胺,而拮抗劑中epinastine=mianserin>SCH23390=chlorpromazine,其它4種
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