雷公藤內(nèi)酯醇對人結(jié)腸癌SW480的體內(nèi)外抗癌作用及相關(guān)機制的研究.pdf

1、雷公藤內(nèi)酯醇對人結(jié)腸癌SW480的體內(nèi)外抗癌作用及相關(guān)機制的研究雷公藤內(nèi)酯醇(triptolide，TPL)又稱雷公藤甲素，是從衛(wèi)矛科雷公藤屬中分離到的主要有效成分，系二萜內(nèi)酯化合物，藥理活性強，具有抗炎、抗生育和免疫調(diào)節(jié)等作用，能抑制多種腫瘤細胞的增殖，具有廣泛的抗瘤譜，還能增加腫瘤對化療藥物的敏感性，是比較有前途的抗腫瘤藥物。但其毒性較大，安全范圍較窄，妨礙了其在臨床上的進一步推廣。本單位的前期研究發(fā)現(xiàn)TPL對人結(jié)腸癌等消化道腫瘤的

2、裸鼠移植模型具有較強的抗癌作用，強于臨床上消化道腫瘤常用的化療藥物。由于在臨床上對消化道常見實體瘤的化療通常由一個以上的化療藥組成合理的化療方案進行治療。因此，在深入探討TPL的作用特點與作用機制的基礎(chǔ)上尋找與TPL具有協(xié)同作用的抗癌藥物聯(lián)合應(yīng)用于消化道腫瘤的治療，既降低TPL使用劑量又發(fā)揮其抗癌效應(yīng)，就成為現(xiàn)在急需解決的主要問題。盡管文獻報道，雷公藤內(nèi)酯醇抗腫瘤作用可能通過多種機制，但其確切的抗癌機制仍未十分明確。因此，我們認為有必要

3、對雷公藤內(nèi)酯醇及其與其它抗癌藥聯(lián)合作用抗腫瘤的機制進行深入探討。 一、雷公藤內(nèi)酯醇體外抗結(jié)腸癌細胞SW480作用及相關(guān)機制的研究 為了探討TPL抑制SW480細胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用特點與作用機制，分別研究了TPL，對拓撲異構(gòu)酶、微管蛋白、HSP70及與其相關(guān)的細胞增殖和凋亡信號分子的影響。 研究方法： (1)用MTT法觀察雷公藤內(nèi)酯醇對細胞增殖的影響； (2)用集落形成法觀察TPL對細胞集落形成

4、的影響； (3)用AO/EB熒光染色法檢測細胞凋亡率； (4)從SW480細胞中提取含有的TOPO Ⅰ、TOPO Ⅱ粗酶溶液用于實驗，通過TOPO Ⅰ、TOP0 Ⅱ介導(dǎo)的負超螺旋pBR322質(zhì)粒解旋反應(yīng)檢測TPL對TOPO Ⅰ、TOPO Ⅱ酶活性的影響： (5)用濁度法檢測，TPL對提取的豬腦微管蛋白體外聚合反應(yīng)的影響； (6)分光光度法檢測TPL對細胞caspase-3和caspase-9活性的影響；

5、 (7)用RT-PCR半定量法檢測TPL對SW480細胞HSP70 mRNA的影響； (8)用Western blot方法觀察TPL對熱休克蛋白70(HSP70)及與細胞增殖和凋亡有關(guān)信號分子的影響； (9)用AO-relocation法、AO-uptake法觀察TPL對溶酶體結(jié)構(gòu)的影響； (10)SB203580預(yù)處理對TPL誘導(dǎo)SW480細胞增殖抑制和凋亡的影響。 結(jié)果顯示： (1)TP

6、L抑制SW480細胞增殖，呈時間和劑量依賴關(guān)系，TPL作用48小時，IC50約為14.14ng/ml； (2)TPL影響SW480細胞的集落形成，呈量效關(guān)系； (3)TPL誘導(dǎo)SW480細胞凋亡，呈劑量依賴關(guān)系； (4)TPL在有效濃度對SW480細胞TOPO Ⅰ的酶活性無明顯影響；當(dāng)TPL濃度高達到400μg/ml時，才能夠抑制SW480細胞TOPO Ⅱ的酶活性； (5)TPL 0.1-10μg/ml不

7、抑制體外微管蛋白的聚合，相反有一定促進微管蛋白聚合的趨勢，但是差異不顯著； (6)TPL在有效濃度能增加細胞caspase-3和caspase-9的活性； (7)TPL在有效濃度能下調(diào)HSP70 mRNA和蛋白表達，且呈量效及時效關(guān)系； (8)TPL在有效濃度能下調(diào)p53、c-myc、Bcl-2和P-Erk1/2蛋白含量；上調(diào)Bax蛋白和p-p38蛋白含量；不影響Erk1/2蛋白的表達； (9)SW480

8、細胞經(jīng)TPL處理后溶酶體結(jié)構(gòu)受到一定程度的破壞； (10)p38特異性抑制劑SB203580部分阻斷TPL對SW480細胞的增殖抑制和凋亡作用。 二、雷公藤內(nèi)酯醇與奧沙利鉑合用對SW480細胞的抑制作用及相關(guān)機制的研究 結(jié)腸癌治療產(chǎn)生耐藥的原因之一，是化療藥物誘導(dǎo)細胞大量表達HSP70，TPL在體外對SW480細胞產(chǎn)生抗癌作用的同時可下調(diào)HSP70，這一特點提示，TPL與結(jié)腸癌治療的常用藥奧沙利鉑(Oxalipl

9、atin，OXA)聯(lián)合應(yīng)用可能具有協(xié)同效應(yīng)。本研究觀察TPL與OXA聯(lián)合對結(jié)腸癌SW480細胞增殖和凋亡的影響；觀察TPL與OXA合用對HSP70以及與細胞增殖和凋亡有關(guān)的信號分子的影響。 研究方法： (1)用MTT法觀察TPL與OXA聯(lián)合對細胞增殖的影響； (2)用集落形成法觀察TPL與OXA聯(lián)合對細胞集落形成的影響； (3)用流式細胞儀(Flow Cytometry,FCM)檢測TPL與OXA聯(lián)合對細

10、胞凋亡的影響； (4)分光光度法檢測TPL與OXA聯(lián)合對細胞caspase-3和caspase-9活性的影響； (5)用Western blot方法觀察TPL與OXA聯(lián)合對熱休克蛋白70(HSP70)及與細胞增殖和凋亡有關(guān)信號分子的影響； (6)SB203580預(yù)處理對TPL與OXA聯(lián)合誘導(dǎo)SW480細胞增殖抑制和凋亡的影響。 結(jié)果顯示： (1)TPL與OXA協(xié)同抗SW480細胞增殖，作用48h的

11、協(xié)同指數(shù)CI<1.1； (2)TPL協(xié)同OXA抗SW480細胞集落的形成(CI<0.9)； (3)TPL與OXA協(xié)同誘導(dǎo)SW480細胞的凋亡； (4)TPL與OXA協(xié)同增加細胞caspase-3和caspase-9的活性； (5)OXA能上調(diào)SW480細胞的HSP70的水平，TPL與OXA聯(lián)用后可下調(diào)OXA增高的HSP70水平，還可減少細胞原有的HSP70水平； (6)TPL協(xié)同OXA下調(diào)p53蛋

12、白的表達，還可協(xié)同上調(diào)Bax、p-p38蛋白的表達； (7)TPL與OXA聯(lián)合對P-Erk1/2、Erk1/2蛋白無明顯影響； (8)SB203580部分阻斷TPL與OXA聯(lián)合對SW480細胞的增殖抑制和凋亡作用。 三、雷公藤內(nèi)酯醇與奧沙利鉑合用對SW480細胞裸鼠異種移植瘤的作用及相關(guān)機制的研究 雷公藤內(nèi)酯醇與奧沙利鉑合用在體外可以協(xié)同抑制SW480細胞的生長并誘導(dǎo)細胞凋亡，那么二者對SW480細胞裸鼠

13、移植瘤的增殖是否也有協(xié)同抑制作用，其中可能的機制又有哪些? 研究方法： (1)建立SW480細胞裸鼠異種移植瘤模型； (2)實驗設(shè)2％丙二醇生理鹽水陰性對照組、雷公藤內(nèi)酯醇組(0.1mg/kg)、奧沙利鉑組(5mg/kg)、雷公藤內(nèi)酯醇和奧沙利鉑聯(lián)合組(TPL 0.1mg/kg+OXA 5mg/kg)，每組6只裸鼠。雷公藤內(nèi)酯醇采用尾靜脈給藥，每2天給藥一次，共7次；奧沙利鉑采用腹腔給藥，每3天給藥一次，共5次。

14、未次給藥后24小時，處死裸鼠。稱量離體瘤塊重量、計算抑瘤率： (3)摘除眼球取血檢測血常規(guī)及肝腎功能； (4)HE染色光鏡下觀察腫瘤組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)； (5)免疫組織化學(xué)檢測TPL與OXA對腫瘤組織HSP70蛋白表達的影響； (6)免疫印跡檢測TPL與OXA對腫瘤組織中HSP70、p53、Bax的蛋白表達的影響。 結(jié)論： 1.TPL能抑制SW480細胞增殖，呈量效、時效關(guān)系，作用48hIC5

15、0約為14.14ng/ml；TPL 8～100ng/ml作用48h誘導(dǎo)SW480細胞凋亡，呈量效關(guān)系； 2.TPL的濃度高達到400μg/ml時，能夠抑制SW480細胞拓撲異構(gòu)酶Ⅱ的活性，但對拓撲異構(gòu)酶Ⅰ的活性無明顯影響； 3.TPL 0.1～10 μg/ml不抑制體外微管蛋白的聚合，相反有一定促進微管蛋白聚合的趨勢，但是差異不顯著； 4.TPL抑制SW480細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡的作用可能與其下調(diào)HSP70的表

16、達，并下調(diào)突變型p53、Bcl-2蛋白的表達和增強caspase-3、caspase-9、的Bax活性，以及對溶酶體結(jié)構(gòu)的破壞有關(guān)；還可能與TPL促進Bax蛋白表達、激活p-p38 MAPK、抑制p-Erk1/2和c-myc有關(guān)： 5.p38抑制劑SB203580能部分逆轉(zhuǎn)TPL誘導(dǎo)的細胞凋亡，表明p38 MAPK的激活在TPL誘導(dǎo)凋亡中起重要作用； 6.TPL協(xié)同OXA抑制SW480細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡的作用可能與T

17、PL能對抗OXA誘發(fā)的HSP70蛋白高表達，并下調(diào)突變型p53蛋白的表達和增強caspase-3、caspase-9、Bax的活性有關(guān)；還可能與TPL能協(xié)同OXA促進Bax蛋白表達、激活p38MAPK有關(guān)；p38抑制劑SB203580能部分逆轉(zhuǎn)TPL與OXA聯(lián)合誘導(dǎo)的細胞凋亡，表明p38 MAPK的激活在TPL與OXA聯(lián)合誘導(dǎo)凋亡中起重要作用； 7.低劑量TPL能抑制SW480裸鼠異種移植瘤的生長；低劑量TPL與OXA聯(lián)合對SW