高血壓性別差異與T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的關(guān)系及淫羊藿苷類性激素保護(hù)效應(yīng)機(jī)制研究.pdf

1、本課題研究分為兩部分:文獻(xiàn)綜述和實(shí)驗(yàn)研究。
　　1.文獻(xiàn)綜述:本部分從性激素與高血壓、高血壓性別差異與T細(xì)胞免疫研究進(jìn)展、淫羊藿苷的心血管保護(hù)作用及機(jī)制研究進(jìn)展三個(gè)方面進(jìn)行綜述。
　　2.實(shí)驗(yàn)研究:包括以下三個(gè)部分。
　　研究一:Rag-1-/-小鼠骨髓移植輻射劑量確定及骨髓移植成功率檢測(cè)
　　目的:探索受體Rag-1-/-小鼠骨髓移植輻射劑量，并通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)受體Rag-1-/-小鼠在植入供體B6小鼠骨髓細(xì)

2、胞后B6小鼠骨髓細(xì)胞所占比例，鑒定骨髓移植手術(shù)是否成功。為后續(xù)研究提供較為成熟的骨髓移植模型。
　　方法:選取骨髓細(xì)胞(bone marrow cells，BM)表面表達(dá)CD90.2（即CD90.2+）的具有免疫缺陷的Rag-1-/-小鼠做受體，骨髓細(xì)胞表面表達(dá)CD90.1（即CD90.1+）的雄性B6小鼠作為供體，在Rag-1-/-小鼠接受500rads或800rads伽馬射線照射干預(yù)后，將B6小鼠骨髓細(xì)胞分離提取，并以5×10

3、7個(gè)細(xì)胞/只的劑量經(jīng)眼球后靜脈叢注入Rag-1-/-小鼠體內(nèi)形成B6-BM→Rag-1-/-復(fù)合體小鼠。三周后，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)復(fù)合體小鼠外周血由骨髓細(xì)胞分化而來的外周單個(gè)核細(xì)胞表面CD90.1表達(dá)比例，推測(cè)骨髓移植成功與否。
　　結(jié)果:
　　①Rag-1-/-小鼠在給予500rads射線照射后，無論是否給予B6小鼠骨髓移植，都能夠健康存活至照射后50天，體重逐漸增加。而給予800rads照射的Rag-1-/-小鼠，未給予

4、骨髓移植（Rag-1-/-M+800rads組），則小鼠在照射后三周內(nèi)體重驟然降低，陸續(xù)死亡;而給予B6小鼠骨髓移植的Rag-1-/-小鼠(BMM→Rag-1-/-M+800rads)卻能夠健康存活達(dá)射線照射后的50天，體重逐漸增加。
　?、诹魇郊?xì)胞檢測(cè)結(jié)果表明，Rag-1-/-小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞表面主要表達(dá)CD90.2(96.12±0.83％)。B6小鼠單個(gè)核細(xì)胞表面主要表達(dá)CD90.1(98.85±1.04％)。當(dāng)用500r

5、ads的射線照射Rag-1-/-小鼠并給予B6小鼠骨髓細(xì)胞移植，骨髓分化而來的單個(gè)核細(xì)胞表面CD90.1的比例只有49.7±0.97％，而CD90.2的比例也只有50.3±1.11％。當(dāng)用800rads射線照射Rag-1-/-小鼠并給予B6小鼠骨髓細(xì)胞移植，則檢測(cè)由骨髓分化來的單個(gè)核細(xì)胞表面CD90.1表達(dá)可達(dá)93.16±1.53％，大于90％。
　　結(jié)論:800rads伽馬射線照射Rag-1-/-小鼠能夠不可逆的損傷其骨髓細(xì)胞，

6、給予照射后的Rag-1-/-小鼠接受來自供體B6小鼠5×107個(gè)骨髓細(xì)胞移植后，供體B6小鼠骨髓細(xì)胞替代比例達(dá)90％以上。骨髓移植模型成功。
　　研究二:高血壓鼠性別差異與T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的關(guān)系的研究
　　目的:研究性染色體在高血壓性別差異中的作用，及雌雄性染色體差異對(duì)T細(xì)胞分化的影響。
　　方法:給予受體雄性Rag-1-/-小鼠800rads伽馬射線照射并分別植入雌、雄(M orF)不同性別供體C57小鼠的骨髓細(xì)胞建立

7、BMM→Rag-1-/--M及BMF→Rag-1-/--M復(fù)合體模型。通過皮下植入AngⅡ緩釋泵，給予兩種復(fù)合體小鼠AngⅡ干預(yù)后，觀察雄性Rag-1-/-小鼠在植入具有雌、雄不同性染色體的骨髓細(xì)胞后，兩類復(fù)合體小鼠生存時(shí)間、體重、血壓、心率的差異。同時(shí)，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)具有雌、雄不同性染色體的骨髓細(xì)胞在移植入同一性激素內(nèi)環(huán)境下分化的外周血及脾細(xì)胞中T細(xì)胞分化亞型的情況。
　　結(jié)果:
　?、倥c未行射線干預(yù)的Rag-1-/-

8、-M組小鼠相比，BMF-→Rag-1-/--M+800rads組及BMM→Rag-1/--M+800rads組小鼠皆能健康存活至骨髓移植后54天。而給予800rads射線照射而未給予骨髓移植的Rag-1-/--M+800rads組小鼠在接受輻射后23天內(nèi)相繼死去。
　?、诠撬枰浦残g(shù)后，與BMF→Rag-1-/--M+800rads組相比BMM→Rag-1-/--M+800rads組小鼠體重明顯增加（P＜0.01）。
　?、墼?/p>

9、AngⅡ干預(yù)后，BMF→Rag-1-/--M+800rads組小鼠血壓明顯高于BMM→Rag-1-/--M+800rads組(P＜0.01)。
　　④在AngⅡ干預(yù)后，BMF-→Rag-1-/--M+800rads組小鼠心率明顯快于BMM→Rag-1-/--M+800rads組(P＜0.01)。
　　結(jié)論:性染色體差異是除性激素外另一個(gè)導(dǎo)致高血壓性別差異的因素。在性激素類型相同的條件下，與雄性性染色體相比，雌性性染色體的存在

10、能夠升高T細(xì)胞亞型中Th17細(xì)胞亞型的分化比例，從而使個(gè)體針對(duì)AngⅡ產(chǎn)生較高的血壓。
　　研究三:淫羊藿苷對(duì)自發(fā)型高血壓大鼠血壓調(diào)節(jié)的類性激素效應(yīng)及機(jī)制研究
　　目的:觀察外源性性激素及本身性染色體對(duì)去勢(shì)SHR大鼠血壓、心率、外周血及脾細(xì)胞中T細(xì)胞亞型分化的影響。同時(shí)探索淫羊藿苷對(duì)去勢(shì)SHR大鼠血壓調(diào)節(jié)的類性激素作用，并研究其作用機(jī)制。
　　方法:給予雄性SHR大鼠睪丸切除術(shù)及給予雌性SHR大鼠卵巢切除術(shù)建立雌雄去勢(shì)

11、高血壓模型。分別給予雌、雄去勢(shì)高血壓大鼠雌二醇、睪酮及高低劑量的淫羊藿苷，雌雄激素受體抑制劑等藥物干預(yù)，將去勢(shì)雄性實(shí)驗(yàn)用鼠分為7個(gè)組,將去勢(shì)雌性實(shí)驗(yàn)用鼠分為7個(gè)組,定期檢測(cè)各組大鼠體重、血壓、心率變化。給藥6周后處死大鼠，取大鼠脾臟、心臟、左右腎臟、及子宮（雌性），計(jì)算大鼠各臟器系數(shù)。
　　結(jié)果:
　?、俳o予睪酮干預(yù)后，雄性SHR大鼠體重明顯增加（P＜0.01）。給予雌二醇干預(yù)后，雌性SHR大鼠體重明顯降低（P＜0.01）。

12、給予淫羊藿苷干預(yù)，雌雄去勢(shì)SHR大鼠體重?zé)o明顯變化（P＞0.05）。
　　②給予雌二醇、淫羊藿苷都能夠使去勢(shì)的雄性SHR大鼠血壓降低(P＜0.01)，而給予睪酮卻能使血壓升高（P＜0.01）。給予雌二醇及淫羊藿苷能夠使去勢(shì)雌性SHR大鼠血壓降低(P＜0.01)，而給予睪酮卻能夠使血壓升高（P＜0.01）;且淫羊藿苷這種作用能夠被雌激素受體拮抗劑所阻斷（P＜0.01）。
　　③給予去勢(shì)雄性SHR大鼠睪酮及淫羊藿苷高劑量干預(yù)能夠

13、明顯降低其心率(P＜0.01)，而雌二醇對(duì)心率無明顯影響(P＞0.05)。淫羊藿苷高劑量的作用能夠被雄激素受體拮抗劑所阻斷(P＜0.01)。給予去勢(shì)雌性SHR大鼠睪酮及淫羊藿高劑量干預(yù)能夠明顯降低心率(P＜0.01)，而雌二醇對(duì)心率無明顯影響（P＞0.05）。
　　④睪酮能夠增加去勢(shì)雄性SHR大鼠心臟及左右腎臟重量（P＜0.01）。與雌性WKY組大鼠相比，雌性SHR組大鼠脾臟重量明顯增加（P＜0.01）。睪酮能夠增加去勢(shì)雌性SHR

14、大鼠心臟、子宮及左右腎臟重量(P＜0.01)，而降低脾臟重量（P＜0.01）。雌二醇能夠降低去勢(shì)雌性SHR大鼠脾臟重量明顯（P＜0.01），卻對(duì)心臟及雙腎重量無明顯影響（P＞0.05）;淫羊藿苷高劑量能夠降低去勢(shì)雌性SHR大鼠脾臟重量（P＜0.01）。
　　⑤大鼠主動(dòng)脈HE及Masson染色結(jié)果示:雌雄去勢(shì)SHR大鼠較其同一性別WKY對(duì)照組主動(dòng)脈的纖維化程度高。給予雄性去勢(shì)SHR大鼠雌二醇及淫羊藿苷干預(yù)能夠降低其主動(dòng)脈纖維化程度，

15、而給予睪酮卻無明顯改善。且淫羊藿苷改善去勢(shì)雄性SHR大鼠主動(dòng)脈纖維化的作用能夠被雄激素受體拮抗劑阻斷。給予雌性去勢(shì)SHR大鼠雌二醇及淫羊藿苷干預(yù)能夠降低其主動(dòng)脈纖維化程度，而給予睪酮?jiǎng)t無明顯改善。且淫羊藿苷降低去勢(shì)雌性SHR大鼠主動(dòng)脈纖維化的作用能夠部分被雌激素受體拮抗劑所阻斷。
　?、薷鹘M大鼠外周血流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果:
　　睪酮及淫羊藿苷能夠降低去勢(shì)雄性SHR大鼠外周血中Th細(xì)胞分化比例(P＜0.01)，雌二醇卻無明顯影響(

16、P＞0.05)。雌二醇、睪酮、淫羊藿苷對(duì)去勢(shì)雌性SHR大鼠外周血Th細(xì)胞無明顯影響（P＞0.05）。
　　睪酮、淫羊藿苷能夠降低去勢(shì)雄性SHR大鼠外周血Tc細(xì)胞分化比例（P＜0.05），而雌二醇卻無此作用（P＞0.05）。且淫羊藿苷的作用能夠被雄激素受體拮抗劑阻斷（P＜0.05）。雌二醇、淫羊藿苷能夠降低去勢(shì)雌性SHR大鼠外周血Tc細(xì)胞分化比例（P＜0.05），而睪酮無此作用（P＞0.05）。
　　結(jié)論:1.雌二醇能夠降低去

17、勢(shì)雌性SHR大鼠的血壓，這一作用是與雌二醇降低AngⅡ的釋放，改善主動(dòng)脈纖維化及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，增加其外周血及脾細(xì)胞中T細(xì)胞Tregs亞型的分化比例而降低Tc亞型的分化比例有關(guān)。而雌二醇降低去勢(shì)雄性SHR大鼠血壓與雌二醇對(duì)外周血及脾細(xì)胞中T細(xì)胞亞型分化比例的調(diào)節(jié)無關(guān)。2.睪酮能夠升高去勢(shì)雌、雄SHR大鼠的血壓，降低雌、雄SHR大鼠的心率。此作用是與睪酮增加AngⅡ的釋放，增加主動(dòng)脈纖維化及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)，而與調(diào)節(jié)外周血及脾細(xì)胞中T細(xì)胞亞