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文檔簡介
1、長鏈非編碼RNAs(Long non-coding RNAs,lncRNAs),是轉(zhuǎn)錄本長度在200nt-100kb之間,存在于核內(nèi)或胞漿內(nèi),它們本身并不編碼蛋白或很少有編碼蛋白質(zhì)的功能。但越來越多的證據(jù)表明,lncRNAs與癌癥的發(fā)生存在密切的聯(lián)系,且在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中存在差異表達(dá)。異常表達(dá)的lncRNAs可能在腫瘤發(fā)生中起著重要的作用。有的lncRNAs可以促進(jìn)癌變,使其在卵巢癌中高度表達(dá);有的lncRNAs可以抑制腫瘤,使其受
2、到抑制。卵巢癌(Ovarian cancer)作為一種惡性腫瘤,生長迅速,易擴(kuò)散。但通過積極的手術(shù)治療及鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療,60%~80%的患者在一線治療后能獲得臨床完全緩解。而鉑類敏感性的不同成為選擇挽救治療的重要參考依據(jù),在臨床應(yīng)用中顯示出越來越大的作用。本研究基于二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA sequencing,RNA-Seq)的卵巢癌鉑類敏感和耐藥數(shù)據(jù),通過生物信息學(xué)方法,系統(tǒng)識(shí)別出卵巢癌鉑類敏感和耐藥lncRNAs,并對(duì)其差異表
3、達(dá)及其相關(guān)功能進(jìn)行研究,主要研究內(nèi)容如下:
1)從ArrayExpress數(shù)據(jù)庫中下載基于Immila平臺(tái)的RNA-Seq雙端、在卵巢癌鉑類敏感和耐藥條件下的12個(gè)樣品數(shù)據(jù)。應(yīng)用FastQC、FASTX-Toolkit以及Kmer直方圖方法對(duì)并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估;同時(shí)根據(jù)本研究內(nèi)容數(shù)據(jù)的特點(diǎn),制定了一個(gè)合理的數(shù)據(jù)預(yù)處理方法。
2)在對(duì)讀段預(yù)處理的基礎(chǔ)上進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組重建,包括轉(zhuǎn)錄組映射(Mapping)和裝配(Assemb
4、ly)。先使用tophat2進(jìn)行讀段映射,結(jié)果讀段映射到基因組上的比率在93.6%~94.4%,讀段雙端完全映射上的比率在79.20%~83.6%;然后使用Cufflinks對(duì)映射上的讀段進(jìn)行裝配,結(jié)果裝配出了124,361個(gè)轉(zhuǎn)錄本,分布在78,900個(gè)不同的Loci(位點(diǎn))上。
3)提出了一種系統(tǒng)識(shí)別卵巢癌鉑類敏感和耐藥lncRNAs的方法。首先通過對(duì)轉(zhuǎn)錄本的長度、外顯子數(shù)量和最大讀段覆蓋度等對(duì)編碼轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行過濾;然后通過使
5、用UCSC、RefSeq、Ensembl以及Encode4等數(shù)據(jù)庫注釋來濾除掉編碼蛋白轉(zhuǎn)錄本;在此基礎(chǔ)上使用編碼潛能工具對(duì)剩下的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行編碼潛能預(yù)測(cè),剩下的非編碼轉(zhuǎn)錄本成為候選lncRNAs轉(zhuǎn)錄本;最后對(duì)候選的lncRNAs轉(zhuǎn)錄本,使用HMMER-3對(duì)其蛋白域進(jìn)行估計(jì),從而得到潛在的lncRNAs轉(zhuǎn)錄本,并從中鑒定出卵巢癌鉑類敏感和耐藥lncRNAs共1,325個(gè),其中已知的1,162個(gè)和新的163個(gè)。
4)對(duì)識(shí)別出的卵巢癌
6、鉑類敏感和耐藥lncRNAs進(jìn)行差異表達(dá)分析研究。通過分析,有46個(gè)lncRNAs具有明顯的差異表達(dá)(fold change≥2),包括6個(gè)新的lncRNAs和40個(gè)已知的lncRNAs;為了更進(jìn)一步分析差異表達(dá)的卵巢癌敏感和耐藥lncRNAs的功能,我們分別對(duì)其進(jìn)行了GO富集分析和通路(Pathway)分析。通過對(duì)lncRNAs的GO功能富集分析,結(jié)果顯示,差異表達(dá)的lncRNAs與bingding(organic cyclic co
7、mpound binding、ion binding等)、子宮內(nèi)發(fā)育以及免疫進(jìn)程等相關(guān);通過對(duì)lncRNAs的Pathway分析,結(jié)果顯示主要影響通路有核苷酸代謝、鈣離子信號(hào)通路、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、次級(jí)代謝生物學(xué)合成以及癌癥中轉(zhuǎn)錄失調(diào)等相關(guān)。
5)對(duì)差異表達(dá)的lncRNAs,使用RT-PCR對(duì)其表達(dá)量進(jìn)行驗(yàn)證。為此,我們從中挑選出3個(gè)lncRNAs(2個(gè)來自于已知的lncRNAs,1個(gè)為新的lncRNAs),分別對(duì)其表達(dá)量進(jìn)行驗(yàn)
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