云斑天牛纖維素酶Ⅱ轉(zhuǎn)基因家蠶的制作及其相關特性研究.pdf

1、飼料效益一直是家蠶育種家所關注的經(jīng)濟性狀。國內(nèi)外學者研究認為二十世紀八十年代推廣的蠶品種與前期推廣的品種相比，雖然繭絲成績有了顯著提高，但蠶的消化率以及飼料效率沒有變化;目前，我國生產(chǎn)上推廣的蠶品種的飼料效率仍沒有提高。
　　 桑葉是家蠶的主要飼料來源，家蠶從桑葉中攝取維持身體機能和成長所必需的各種營養(yǎng)成分。桑葉干物質(zhì)由蛋白質(zhì)、糖類、脂質(zhì)等組成，其中，大部分蛋白質(zhì)、脂質(zhì)可以被蠶體吸收利用;由于蠶體中腸沒有降解纖維素的相應的酶，作

2、為桑葉細胞壁主要成分的纖維素的吸收率只有0.04％，不能被蠶兒吸收利用，是影響桑葉消化吸收的主要因素。
　　 轉(zhuǎn)基因技術可使外源基因在轉(zhuǎn)基因宿主細胞中整合、表達。利用轉(zhuǎn)基因技術，可以打破自然條件下的種系隔離，使基因能在種系遙遠的機體間流動。本研究首先從云斑天牛中腸組織中克隆到昆蟲內(nèi)源性纖維素酶Ⅱ基因（β-1，4-endoglucanaseⅡfromthebeetle，Batocerahorsfieldi，Bh-EGaseⅡ），在

3、家蠶BmN細胞及家蠶幼蟲中表達了重組酶Bh-EGaseⅡ，并對該酶的活性進行分析，構(gòu)建了可分泌Bh-EGaseⅡ基因的轉(zhuǎn)基因載體，初步探討了Bh-GaseⅡ基因?qū)倚Q幼蟲的糖代謝及繭質(zhì)成績的影響。獲得的主要結(jié)果如下:
　　 1.云斑天牛內(nèi)源性纖維素酶Ⅱ的cDNA克隆、表達和酶活性分析
　　 利用RACE方法從云斑天牛（Batocerahorsfieldi）中腸組織中克隆出一個新的纖維素酶基因，即為Bh-EGaseⅡ。該基

4、因結(jié)構(gòu)是由一個外顯子組成，沒有內(nèi)含子。Bh-EGaseⅡ?qū)儆谔擒账饷讣易?5(Glycosylhydrolasefamilies45，GHF45)，在其氨基酸序列的第36-48位置有1個GHF45非常保守的催化位點，并且具有3個N-糖基化位點。
　　 Bh-EgaselⅡ蛋白質(zhì)的氨基酸序列中只有一個單一的催化結(jié)構(gòu)域，不存在纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和間隔序列，這與來源于桑天牛(Aprionagermari)的Ag-EgaseⅠ、Ag-E

5、gaseⅡ以及白蟻后腸中的纖維素酶的氨基酸序列相類似。Bh-EGaseⅡ與Ag-EGaseⅡ的相似性達93.72％;與Ag-EGaseⅠ的相似性達73.64％;與三化螟甲蟲（O.albomarginatachamela）的β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶的相似性達67.78％。
　　 通過Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)，在BmN細胞和家蠶5齡幼蟲中表達出Bh-EgaseⅡ。經(jīng)SDS-PAGE檢測和Westernblot分析，結(jié)果顯

6、示:細胞裂解液中的蛋白質(zhì)約為28kDa，而細胞上清液和家蠶幼蟲血淋巴中的蛋白質(zhì)約為33kDa。這可能是因為該基因有3個潛在的N-糖基化修飾位點，56-58(N-K-S)、99-101(N-S-T)、237-239(N-Y-S)，并有14個保守的半胱氨酸(C)殘基，分泌到細胞外的蛋白經(jīng)翻譯后折疊、糖基化修飾后蛋白質(zhì)分子量增大。
　　 Bh-EagseⅡ與Ag-EgaseⅡ的相似度達93.72％，而Ag-EgaseⅡ的99-101(

7、NST)的N糖基化位點是該酶是否有活性的關鍵，這也是已知甲蟲GHF45的纖維素酶的共性。用剛果紅染色法檢驗了重組Bh-EgaseⅡ的酶活性，結(jié)果是細胞裂解液中的重組Bh-EgaseⅡ酶沒有活性;與之相反，細胞上清液及幼蟲血淋巴中的重組酶具有活性，這可能是因為后者經(jīng)翻譯后糖基化修飾及折疊所致。
　　 在BmN細胞上清液、幼蟲血液中表達的Bh-EGaseⅡ的酶活力大約是928U/mg，重組酶最佳pH值與最佳溫度分別為pH6.0和50

8、℃，在pH8.0-9.0、20-30℃時的酶活性能維持在60％左右，符合家蠶中腸的酸堿環(huán)境和家蠶飼養(yǎng)的適宜溫度。實驗結(jié)果有助于進一步了解Bh-EgaseⅡ的基因結(jié)構(gòu)和昆蟲纖維素酶的酶學活性;該基因是一個轉(zhuǎn)基因提高桑蠶纖維素利用效率的合適基因。
　　 2.轉(zhuǎn)Bh-EGaseⅡ基因載體的構(gòu)建及在BmN細胞中的檢驗
　　 構(gòu)建基于piggyBac的Bh-EGaseⅡ的轉(zhuǎn)基因表達載體，通過轉(zhuǎn)染方法將重組質(zhì)粒導入到家蠶BmN細胞中

9、，利用熒光檢測方法證明重組質(zhì)粒中的報告基因eGFP獲得表達;剛果紅染色法檢驗了Bh-EGaseⅡ酶的活性。本實驗結(jié)果為進一步使轉(zhuǎn)基因載體中的Bh-EGaseⅡ在家蠶幼蟲中的成功表達奠定了基礎。
　　 3.利用外源Bh-EGaseⅡ基因提高家蠶纖維素利用率的研究初探
　　 按照標準方法顯微注射家蠶大造品種的早期胚胎，篩選獲得了攜帶有綠色熒光標記基因的轉(zhuǎn)基因陽性個體，建立單獨的轉(zhuǎn)基因品系。利用基因組PCR、反向PCR技術手段

10、對轉(zhuǎn)基因個體的插入位點進行了分子水平的檢測，結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)基因品系的大造基因組中插入了外源基因，插入位點位于第4號染色體上。
　　 用DNS比色法測定轉(zhuǎn)基因家蠶腸腔中食物還原糖的OD540nm值，結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)基因蠶還原糖的平均OD540值為0.429，均方差為0.0024;對照蠶還原糖的平均OD540值為0.381，均方差為0.0021，達顯著差異(P＜0.05)。結(jié)果說明整合到家蠶基因組中的外源Bh-EGaseⅡ基因已在轉(zhuǎn)基因個

11、體中表達并分泌到腸腔中;分泌到腸腔中的Bh-EGaseⅡ酶將腸腔食物中的纖維素降解，致使食物中的還原糖含量升高。
　　 家蠶6-磷酸果糖激酶-1(Bombyxmoriphosphofructokinase，BmPFK)是糖酵解過程的關鍵酶。利用realtimeRT-PCR方法檢測了轉(zhuǎn)基因蠶的BmPFKmRNA的表達量。實驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因家蠶中腸的BmPFK的mRNA的表達量是對照區(qū)的1.58倍，并達到顯著差異(P＜0.05)，說

12、明導入Bh-GaseⅡ基因后，不但使腸腔中的還原糖含量增高，而且使中腸細胞中的糖酵解循環(huán)加快。
　　 糖酵解與蛋白質(zhì)代謝的關系緊密，糖酵解的中間產(chǎn)物可用于合成各種氨基酸的碳架結(jié)構(gòu)，經(jīng)轉(zhuǎn)氨后可生成各種氨基酸;糖分解過程產(chǎn)生的能量可用于氨基酸和蛋白質(zhì)的合成。對轉(zhuǎn)Bh-GaseⅡ基因蠶的繭質(zhì)成績進行了調(diào)查，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因蠶雌雄平均全繭量、繭層量為1.073g、0.134g，分別比對照提高3.5％、3.1％。推測:纖維素是促進食物在中腸