灘涂植物菊芋根際固氮菌群落分析及其內(nèi)生細(xì)菌作用機(jī)制.pdf

1、植物在自然界中并不是孤立存在的，而是通過(guò)自身的代謝活動(dòng)等，在植物周圍環(huán)境以及植物組織內(nèi)部構(gòu)建形成特殊的植物微生態(tài)環(huán)境。植物微生態(tài)環(huán)境是植物與外界進(jìn)行能量和物質(zhì)交流的主要界面，細(xì)菌是其中最主要定居者之一。植物根際土壤中的根際細(xì)菌，受到各種生物以及非生物因素的影響，在環(huán)境中形成復(fù)雜的種群結(jié)構(gòu)，了解植物根際細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)對(duì)實(shí)際的應(yīng)用和生產(chǎn)具有重大的指導(dǎo)意義。植物促生細(xì)菌包括根際細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌，是植物聯(lián)合細(xì)菌中的重要組成部分，主要通過(guò)生物固氮、

2、合成植物生長(zhǎng)素、活化無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)元素等作用機(jī)制，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，在農(nóng)業(yè)、林業(yè)等領(lǐng)域已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。內(nèi)生細(xì)菌直接定殖于植物體內(nèi)的組織細(xì)胞間隙中，獨(dú)特的生長(zhǎng)環(huán)境使之能夠避免外界不利因素的影響，并直接作用于宿主植物，是優(yōu)質(zhì)促生微生物的重要來(lái)源。內(nèi)生環(huán)境中的細(xì)菌除了要面對(duì)宿主植物之外，還能夠與其他內(nèi)生細(xì)菌甚至病原菌通過(guò)信號(hào)分子以及代謝互補(bǔ)等方式進(jìn)行種間交流。群體感應(yīng)系統(tǒng)是細(xì)菌中最為常見(jiàn)、研究最為廣泛的種內(nèi)以及種間交流機(jī)制之一，能夠?qū)?xì)菌的

3、運(yùn)動(dòng)、共生、生物毒性等生理功能進(jìn)行調(diào)控。
　　為了探討根際固氮細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，以及其相應(yīng)的影響因素，本研究針對(duì)固氮細(xì)菌特有的功能基因，優(yōu)化獲得了一種簡(jiǎn)便快捷、重復(fù)性高的半定量分子指紋技術(shù)。從灘涂植物菊芋的根系中，分離獲得了一株具有植物促生活性的內(nèi)生細(xì)菌，并對(duì)其在宿主體內(nèi)的定殖動(dòng)力學(xué)以及植物促生作用進(jìn)行了深入的探索。為闡明內(nèi)生細(xì)菌在其所處微生態(tài)環(huán)境中具體的種間交流作用，本研究以油橄欖種間交流模式結(jié)構(gòu)中的內(nèi)生細(xì)菌作為研究對(duì)象，探討了群

4、體感應(yīng)系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌的具體調(diào)控作用。
　　1.在根際土壤中，難培養(yǎng)、不可培養(yǎng)以及未培養(yǎng)的固氮細(xì)菌在群落中所占的比重極大，傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離技術(shù)并不能夠滿足土壤固氮細(xì)菌群落的研究需要。LH-PCR(Length Heterogeneity Polymerase Chain Reaction)以及T-RFLP(TerminalRestriction Fragment Length Polymorphism)分子指紋圖譜的技術(shù)手段的操作簡(jiǎn)便快捷

5、、重復(fù)性強(qiáng)，已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。以固氮細(xì)菌中與16s rDNA進(jìn)化地位相似的“分子鐘”nifH作為目的基因，本研究檢測(cè)了不同氮素水平下菊芋根際土壤中的固氮細(xì)菌群落。通過(guò)對(duì)比不同的分子指紋圖譜技術(shù)，本研究利用以限制性內(nèi)切酶MnlⅠ作為工具酶的T-RFLP技術(shù)在固氮細(xì)菌群落多態(tài)性的分析中獲得了最豐富的檢出量，并表現(xiàn)出極高的分辨率和可重復(fù)性。菊芋根際土壤中的固氮細(xì)菌受植物根系活動(dòng)的影響，種屬豐度以及多樣性均顯著小于非根際土壤中的固氮細(xì)菌，表

6、現(xiàn)出了顯著的根際效應(yīng)。另外，大量氮肥施用對(duì)菊芋根際固氮細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和多樣性具有負(fù)面影響，從而導(dǎo)致根際固氮細(xì)菌種類和多樣性銳減。
　　2.從灘涂植物菊芋的根系中我們分離獲得了多株內(nèi)生固氮細(xì)菌，其中固氮酶活性最高的菌株為蒼白桿菌Ochrobactrum sp.Mn1，乙炔還原法檢測(cè)其活性，能夠達(dá)到為207.34 nmol·mL-1·h-1。Ochrobactrum sp.Mn1還具有較高的分泌IAA以及活化無(wú)機(jī)磷的特性，并能夠

7、產(chǎn)生大量的鐵載體幫助植物吸收難溶的金屬營(yíng)養(yǎng)。通過(guò)溫室和大田實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)生固氮細(xì)菌Ochrobactrum sp.Mn1對(duì)菊芋具有顯著的促生作用。其促生機(jī)制是多方面的，通過(guò)生物固氮，Ochrobactrum sp.Mn1能夠?yàn)樗拗魈峁┘s占總氮量20％的有效氮營(yíng)養(yǎng);產(chǎn)生的植物生長(zhǎng)素能夠顯著優(yōu)化植物根系發(fā)展;利用解磷特性和分泌的鐵載體，該菌株能夠提高菊芋對(duì)P、K、Fe、Mg等營(yíng)養(yǎng)元素的吸收利用。應(yīng)用綠色熒光蛋白標(biāo)記與內(nèi)生菌再分離技術(shù)，對(duì)O

8、chrobactrum sp.Mn1在不同植物組織部分定殖的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行探究發(fā)現(xiàn)，Ochrobactrum sp.Mn1的定殖部位主要位于菊芋根系和莖的組織細(xì)胞間隙中。尤其是在根系內(nèi)部?jī)?nèi)生細(xì)菌的數(shù)量最高，每克植物根系中約有105個(gè)內(nèi)生細(xì)菌定殖。
　　3.在假單孢桿菌Pseudomonas savastanoi pv.Savastanoi(PSV)侵染油橄欖所形成的腫瘤結(jié)構(gòu)中，AHLs(Acyl-homoserine Lactones

9、)群體感應(yīng)系統(tǒng)具有極為重要的生物學(xué)作用，能夠介導(dǎo)病原菌與內(nèi)生細(xì)菌歐文氏菌Erwinia toletana(ET）之間的種間交流，該體系目前已經(jīng)成為研究物種間信號(hào)交流的重要模式之一。利用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)內(nèi)生細(xì)菌ET的深度測(cè)序我們發(fā)現(xiàn)，AHLs信號(hào)分子能夠?qū).toletana的細(xì)菌運(yùn)動(dòng)、質(zhì)粒接合、生物毒性、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)以及抗生素抗性等多種生理活動(dòng)進(jìn)行調(diào)控。除次生代謝調(diào)控之外，AHLs群體感應(yīng)系統(tǒng)還能夠作用于內(nèi)生細(xì)菌對(duì)碳水化合物的初生代謝