精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)多肽修飾多孔鉭材料對(duì)軟骨細(xì)胞粘附性影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　研究RGD、ColⅡ和RGD/ColⅡ混合修飾多孔鉭支架對(duì)其形貌及軟骨細(xì)胞早期黏附、增殖、基質(zhì)分泌等生物學(xué)行為的影響。探討骨細(xì)胞外基質(zhì)成分修飾多孔鉭做為軟骨組織工程支架材料修復(fù)軟骨缺損、促進(jìn)軟骨再生，恢復(fù)軟骨生理結(jié)構(gòu)與功能的可行性，為進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1.掃描電鏡觀察多孔鉭材料及RGD、ColⅡ和含1mg/mlRGD和1mg/mlⅡ型膠原混合液修飾多孔鉭支架后的形貌特征

2、；檢測(cè)并觀察各組多孔鉭親水性。
　　2.以含0.2mg/mlRGD和1mg/mlⅡ型膠原混合液、含1mg/mlRGD和1mg/mlⅡ型膠原混合液、含5mg/mlRGD和1mg/mlⅡ型膠原混合液、含10mg/mlRGD和1mg/mlⅡ型膠原混合液、單純1mg/ml RGD(Ta-RGD組)及單純1mg/mlⅡ型膠原(Ta-ColⅡ組)分別對(duì)多孔鉭支架進(jìn)行修飾，以未修飾純鉭支架作為陰性對(duì)照組，空白24孔板作為空白對(duì)照組，將第2代軟骨

3、細(xì)胞接種到上述支架上，體外培養(yǎng)2h、4h，沉淀法檢測(cè)各組支架軟骨細(xì)胞粘附率，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并掃描電鏡觀察比較4h時(shí)細(xì)胞在各組鉭材料上的黏附情況。
　　3.兔軟骨細(xì)胞與各組多孔鉭支架體外復(fù)合培養(yǎng)，經(jīng)掃描電鏡觀察比較細(xì)胞在材料上的黏附、形態(tài)、生長(zhǎng)及增殖情況；MTT法檢測(cè)比較各組多孔鉭支架對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的影響；羥脯氨酸法測(cè)定各組多孔鉭上軟骨細(xì)胞分泌 II型膠原量。
　　結(jié)果:
　　1.多孔鉭支架表面成蜂窩狀，

4、空隙分布均勻。掃描電鏡觀察，材料表面為直徑約400~600μm微孔結(jié)構(gòu)，孔隙為三維立體的連通結(jié)構(gòu)，類似于松質(zhì)骨。多孔鉭經(jīng)RGD修飾后，其三維立體多孔結(jié)構(gòu)無(wú)明顯變化，表面有斑點(diǎn)樣涂層。多孔鉭經(jīng)ColⅡ及RGD/ColⅡ混合物修飾后，其三維立體多孔結(jié)構(gòu)亦無(wú)改變，其表面可見(jiàn)一薄膜涂層，分布廣泛，薄厚較均勻。
　　2.親水性測(cè)定：測(cè)得純Ta組、Ta-RGD組、Ta-ColⅡ組及Ta-RGD/ColⅡ1.0mg/ml組支架親水率分別為1.3

5、％±0.1%、1.5%±0.3%、4.1%±0.6%、4.3%±0.5%，修飾后多孔鉭親水率較純鉭顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3.粘附率的檢測(cè)：改性后材料細(xì)胞黏附率較改性前支架均有明顯提高，各Ta-RGD/ColⅡ組＞Ta-ColⅡ組＞Ta-RGD組＞純Ta組，組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。另外不同濃度 RGD與 ColⅡ混合修飾多孔鉭，其粘附率隨 RGD濃度的增加而增加，RGD濃度提高到一定程度后

6、，其促黏附能力存在飽和現(xiàn)象。掃面電鏡觀察結(jié)果印證了上述結(jié)論。
　　4.細(xì)胞增殖檢測(cè)：MTT法進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果顯示，第1天各組間比較，Ta-RGD組＞純Ta組、Ta-ColⅡ組＞純Ta組、Ta-RGD/ColⅡ1.0mg/ml組＞RGD組、Ta-RGD/ColⅡ1.0mg/ml組＞ColⅡ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Ta-ColⅡ組雖高于 Ta-RGD組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；第3天、5天、7天、10天和13

7、天，Ta-RGD/ColⅡ1.0mg/ml組＞Ta-ColⅡ組＞Ta-RGD組＞純Ta組，各組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。掃描電鏡觀察直觀的印證了上述結(jié)論。5羥脯氨酸法測(cè)定各組多孔鉭上軟骨細(xì)胞分泌 II型膠原量，Ta-RGD/ColⅡ1.0mg/ml組＞Ta-ColⅡ組＞Ta-RGD組＞純Ta組，組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.多孔鉭經(jīng) RGD、ColⅡ修飾后其多孔結(jié)構(gòu)無(wú)改變，但親水性