赤擬谷盜RNAi及dsRNA脫靶效應的研究.pdf

1、基因干擾(RNAi)是現(xiàn)代分子生物學領域的重大發(fā)現(xiàn)，該機制在不同進化地位的物種中高度保守。在昆蟲學領域中，RNAi技術不僅為昆蟲的功能基因組研究提供了便捷的方法，也為農業(yè)害蟲的防治提供了新途徑。然而，脫靶效應(off target effect)給RNAi技術蒙上了陰影，是目前RNAi技術應用的最大障礙。嚴重的脫靶效應會導致應用RNAi進行昆蟲功能基因組學研究產(chǎn)生錯誤結論，如果利用RNAi進行害蟲防治出現(xiàn)脫靶效應，就會因為靶標的非特異性

2、而出現(xiàn)嚴重的環(huán)境安全性問題，甚至影響人類健康。因此，在應用RNAi進行害蟲防控的研究中，昆蟲體內脫靶效應的評估和控制是一個亟待解決的科學問題。本文以赤擬谷盜Triboliumcastaneum為研究對象，通過選擇合適的RNAi物質，利用微陣列芯片研究RNAi過程中脫靶效應的發(fā)生并探討可能存在的原因，同時評估了dsRNA脫靶效應預測軟件“dsCheck”的準確性，然后研究了與序列相關脫靶效應相關的dsRNA分子特征，驗證了RNAi過程中非

3、序列特異性脫靶效應的存在。相關的研究成果可以為未來dsRNA的設計以及安全控制提供理論依據(jù)，促進RNAi技術的實踐應用。
　　1.赤擬谷盜中SiRNA與dsRNA引發(fā)的RNAi效應比較
　　siRNA與dsRNA都被廣泛地應用于沉默靶標基因，但實踐發(fā)現(xiàn)在昆蟲活體中siRNA很難引發(fā)RNAi的表型變化。為了證實這一現(xiàn)象同時選擇合適的昆蟲RNAi方法，本研究選擇赤擬谷盜為研究對象，來比較siRNA與dsRNA的干擾效率。實驗利用

4、4個dsRNA和10個siRNA靶向3個不同基因，分別測試了這些干擾RNA對靶標基因的抑制效率以及導致試蟲的畸形率。結果發(fā)現(xiàn)注射不同dsRNA均可以有效抑制目標基因的表達量(55-75％)，且能持續(xù)抑制超過7天，并導致78.8-87.0％的試蟲畸形。但是注射不同的siRNA，多數(shù)對靶基因的表達沒有顯著的抑制作用，10個siRNA只有1個沉默了45％的靶標基因表達量，抑制持續(xù)了僅3天，所有siRNA處理均未能引發(fā)試蟲產(chǎn)生表型變化（畸形）。

5、上述結果表明，siRNA明顯比相應的dsRNA干擾效率低，而且大部分不能引起表型變化。此外，siRNA的干擾效率隨其分子不同，或靶向位置而有很大變化，因此應用siRNA需要仔細篩選。
　　2.赤擬谷盜中dsRNA引起的脫靶效應
　　利用轉基因作物或工程生物表達dsRNA進行害蟲防治具有較好的前景，但目前對昆蟲dsRNA脫靶效應的研究較少，很難進行生物安全控制。本實驗利用赤擬谷盜RefSeq數(shù)據(jù)庫定制的微陣列芯片，通過檢測沉默

6、TcChi1之后赤擬谷盜體內各種基因的表達情況，對dsRNA的脫靶效應進行了研究。結果發(fā)現(xiàn)兩個靶向TcChil基因的不同 dsRNA處理赤擬谷盜后，分別導致了217和225個基因產(chǎn)生顯著的表達量變化（2倍以上，且差異顯著），其中分別有141和151個基因顯著下調。這些基因的功能多樣，大都與代謝過程、外界刺激以及生物學調節(jié)相關。通過生物信息學的方法，依據(jù)序列匹配度鑒定脫靶基因發(fā)現(xiàn)在赤擬谷盜中利用dsRNA進行RNAi，不存在已報道的siR

7、NA種子區(qū)脫靶效應，只是當基因序列中具有一段長度在19nt以上，且與dsRNA匹配約90％的序列片段時，其脫靶概率顯著高于其他基因。此外，還發(fā)現(xiàn)一個基因與RNAi的免疫副反應有關，推測RNAi可能產(chǎn)生非序列特異性免疫反應。由此認為，利用dsRNA進行赤擬谷盜RNAi，可以通過不同途徑引起不同基因產(chǎn)生脫靶效應，其中與dsRNA具有高度相似性的同源基因，脫靶概率明顯高于其他基因。該實驗研究結果對dsRNA的設計以及加深對dsRNA引發(fā)脫靶效

8、應的認識具有重要意義。
　　3.預測軟件dsCheck對dsRNA脫靶效應的預測
　　為了提高RNAi的專一性以及預測脫靶效應的發(fā)生，生物信息學家根據(jù)已知RNAi脫靶效應的原理，設計出了不同算法用于預測脫靶效應，其中dsCheck是專門預測dsRNA脫靶效應的軟件。本研究利用該軟件對第三章中所使用的兩個dsRNA的脫靶基因進行預測，并與實際微陣列芯片檢測結果對比，以期驗證該軟件的預測效果，探索可能的改進途徑。結果發(fā)現(xiàn)，在赤擬

9、谷盜中dsCheck軟件預測dsChi1和dsChi2分別會導致691個和519個基因脫靶，與微陣列芯片檢測結果比對發(fā)現(xiàn)，其中分別只有10個和14個基因的表達受抑制。分析發(fā)現(xiàn)dsCheck軟件的預測準確率，隨理論生成的siRNA與預測脫靶基因的序列相似性降低而急劇下降，序列相似性在94％、89％和84％時，對2個dsRNA脫靶效應的預測準確率分別為14.3％和33.3％、2.6％和8.3％，以及1.0％和1.7％。在果蠅活體和S2細胞中

10、利用dsWg進行RNAi實驗，dsCheck預測都有23個基因脫靶，但實際檢測發(fā)現(xiàn)，分別僅有12個和3個基因表達受到抑制，表明昆蟲活體內的脫靶效應和組培細胞中的有所不同。這些研究結果均表明dsCheck軟件預測dsRNA的脫靶基因準確率極低，主要是由于目前預測軟件僅依據(jù)理論生成siRNA與基因組內不同基因的相似性，沒有掌握dsRNA脫靶的發(fā)生規(guī)律，故還需深入開展研究。
　　4.影響dsRNA脫靶效應的分子特征
　　RNAi的

11、效應分子與非靶標基因的互作，造成非靶標基因的沉默稱為RNAi的脫靶效應。本文基于目標基因沉默水平，利用定量PCR方法評估了dsRNA分子的兩個重要特征對脫靶效應的影響。結果首先發(fā)現(xiàn)，在赤擬谷盜中，當dsRNA序列與mRNA序列相似度超過50％時，脫靶效應發(fā)生的概率逐漸增加，當相似度達到80％時，這些非靶標的mRNA將與靶標基因一樣被沉默。然后使用嵌合dsRNA序列檢測發(fā)現(xiàn)，當dsRNA序列與mRNA序列有一段40bp或者兩段30bp的連

12、續(xù)匹配時，就能夠引發(fā)RNAi效應，而較短的匹配片段則無法觸發(fā)RNAi反應。這些結果提供了昆蟲體內評估dsRNA脫靶效應的兩個標準，這不僅會改善dsRNA的設計，同時會為未來RNAi的使用提供更好的理論依據(jù)。
　　5.赤擬谷盜RNAi過程中非序列特異性脫靶效應的探索
　　昆蟲體內的免疫反應是昆蟲機體抵抗外界物質侵染的能力，RNAi作為昆蟲消除外界病毒RNA的重要途徑在進化上相對保守，而對外源雙鏈RNA是否能夠引發(fā)昆蟲的免疫應答