兩種用于CR檢ISPR-Cas9靶效應(yīng)和脫靶效應(yīng)測新方法的建立.pdf

1、目的：建立基于藍(lán)白篩選技術(shù)進(jìn)行評估CRISPR/Cas9酶活性的方法；使用此方法評估CRISPR/Cas9基因編輯的靶效應(yīng)和脫靶效應(yīng)。
　　方法：人工構(gòu)建基于藍(lán)白斑篩選的含有CRISPR/Cas9靶序列的報告質(zhì)粒，通過菌落產(chǎn)生的藍(lán)變白與白變藍(lán)兩種不同變化，建立在原核水平檢測CRISPR/Cas9靶效應(yīng)和脫靶效應(yīng)的有效方法體系。在藍(lán)變白實驗中，將包括與gRNA完全互補(bǔ)的靶序列，PAM位點突變的靶序列，PAM位點旁1到19位點堿基連續(xù)

2、突變的靶序列等一系列基因片段亞克隆至PMD-19T質(zhì)粒的lacZ基因起始密碼子后，并保持基因閱讀框不發(fā)生移碼,其轉(zhuǎn)入大腸桿菌后對應(yīng)的菌落顏色為藍(lán)色。再將相應(yīng)的gRNA克隆至原核CRISPR/Cas9質(zhì)粒上，共同轉(zhuǎn)化構(gòu)建成功的CRISPR/Cas9和含有對應(yīng)靶點的PMD-19T質(zhì)粒將會導(dǎo)致菌落顏色發(fā)生變化。我們初步通過這種顏色的變化來直觀地判斷是否發(fā)生CRISPR/Cas9剪切作用，后續(xù)通過溶菌實驗以及熒光定量PCR實驗來計算剪切量的多少

3、，從而有效地評估CRISPR/Cas9剪切的靶效應(yīng)和脫靶效應(yīng)。在白變藍(lán)的實驗中，建立了三種用于核酸酶活性檢測的含有雙重復(fù)片段載體。將雙重復(fù)片段載體與藍(lán)白斑篩選相結(jié)合，待測靶序列和重復(fù)片段均位于α-多肽基因編碼序列之內(nèi)，并且預(yù)先設(shè)計使編碼框架發(fā)生移碼效果，這樣的載體自身轉(zhuǎn)化得到的大腸桿菌表現(xiàn)為白色。同時，載體構(gòu)建時設(shè)計的重復(fù)片段之間發(fā)生重組反應(yīng)后能使基因閱讀框架恢復(fù)為不移碼的狀態(tài)。這樣，當(dāng)共轉(zhuǎn)化CRISPR/Cas9使靶序列發(fā)生剪切后,導(dǎo)

4、致在大腸桿菌內(nèi)發(fā)生重復(fù)片段的重新組合，可形成一部分藍(lán)色的菌落斑。藍(lán)色菌落斑的形成，驗證了藍(lán)變白實驗中CRISPR/Cas9剪切的發(fā)生。藍(lán)色菌落斑的多少，與核酸酶的剪切活力的大小相關(guān)，由此確定CRISPR/Cas9是否對靶序列發(fā)生了剪切以及剪切量的多少。同樣地，我們也對重復(fù)片段中間的靶序列的不同位點進(jìn)行單堿基突變，通過觀察共轉(zhuǎn)后生成的藍(lán)菌和白菌的不同的比例，來研究CRISPR/Cas9剪切的靶效應(yīng)和脫靶效應(yīng)。靶序列與gRNA完全互補(bǔ)時，檢

5、測靶效應(yīng)；靶序列與gRNA不完全互補(bǔ)時，則該技術(shù)用于檢測脫靶效應(yīng)。
　　結(jié)果：藍(lán)變白實驗中，原核系統(tǒng)中均可實現(xiàn)gRNA與靶點序列堿基完全互補(bǔ)時，CRISPR/Cas9剪切靶點序列后菌落呈白色；當(dāng)gRNA與靶點序列堿基完全不互補(bǔ)時，剪切后菌落呈藍(lán)色；當(dāng)檢測連續(xù)錯配單堿基的靶序列，所產(chǎn)生菌落則為不同程度的藍(lán)色菌落，總體趨勢為：突變位點越靠近PAM位點，在CRISPR/Cas9剪切后，則菌落的藍(lán)色越深；越遠(yuǎn)離PAM位點，菌落藍(lán)色越淡甚至

6、趨于白色。后續(xù)通過溶菌實驗和熒光定量PCR對CRISPR/Cas9剪切后的菌落進(jìn)行定量分析同樣解釋了此現(xiàn)象，再次確定CRISPR/Cas9的剪切效率非百分之百，采用本方法成功對不同條件下CRISPR/Cas9剪切的靶效應(yīng)和脫靶效應(yīng)進(jìn)行定量。剪切后的菌落藍(lán)色越深，表明被CRISPR/Cas9剪切的靶序列越少，脫靶效應(yīng)越低；剪切后的菌落藍(lán)色越淺，則被剪切的靶序列越多，脫靶效應(yīng)越高。在白變藍(lán)實驗中，構(gòu)建的雙重復(fù)片段載體的報告質(zhì)粒使其LacZ閱

7、讀框移碼，得到的大腸桿菌表現(xiàn)為白色。當(dāng)待測靶序列受到CRISPR/Cas9的編輯時，通過實驗的預(yù)先設(shè)計使菌落再次變?yōu)樗{(lán)色。當(dāng)突變重復(fù)片段之間靶點的單堿基時，突變不同的位點對生成的藍(lán)白菌的比例也有影響,總體趨勢為gRNA與靶點序列堿基完全互補(bǔ)時，重復(fù)片段修復(fù)的效率最高；當(dāng)對靶序列單堿基突變后，修復(fù)效率大大降低，但也有個別位點不受突變的影響。并且不同的雙重復(fù)片段載體修復(fù)的效率不同，HBV病毒重復(fù)片段和含有噬菌體LoxP重復(fù)片段的載體效率較人