通關(guān)藤遺傳多樣性及轉(zhuǎn)錄組研究.pdf

1、通關(guān)藤Marsdenia tenacissima(Roxb.) Wight et Am.為蘿藦科牛奶菜屬植物，以藤莖入藥，具有清熱解毒，止咳平喘的作用，用于喘咳痰多，產(chǎn)后乳汁不通，風(fēng)濕腫痛，瘡癰等?，F(xiàn)代藥理試驗證明，通關(guān)藤還具有抗腫瘤、抗菌、降壓、保肝利尿及調(diào)節(jié)免疫力等多種的作用，尤其是其對肺癌、肝癌有一定的療效通。通關(guān)藤廣泛分布于亞洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)，我國主分布于云南、貴州、四川、廣西等地，為傣族、苗族、壯族常用藥物。
　　近

2、年，以通關(guān)藤為原料的消癌平注射液、消癌平顆粒、通關(guān)藤飲片的市場需求劇增，通關(guān)藤藥材的使用量越來越大，使得通關(guān)藤原料供不應(yīng)求。通關(guān)藤一般需要3～5年才有采收價值，而人們竭澤而漁似的采集，致使通關(guān)藤資源日趨匱乏。目前國內(nèi)外對通關(guān)藤的研究主要集中在化學(xué)成分、藥理作用及臨床應(yīng)用等方面，而對通關(guān)藤的種質(zhì)資源、遺傳多樣性、轉(zhuǎn)錄組方面的研究很少。因此，對野生通關(guān)藤進行資源生境調(diào)查和遺傳多樣研究尤為迫切。有關(guān)通關(guān)藤功能基因的研究也是空白，通過對其轉(zhuǎn)錄組

3、進行分析，了解通關(guān)藤皂苷的合成途徑和參與合成的酶基因，有利于生產(chǎn)出更好的抗腫瘤藥物。
　　本研究利用通關(guān)藤的野生種質(zhì)資源，從表觀形態(tài)、分子生物學(xué)、化學(xué)成分等方面開展通關(guān)藤種質(zhì)資源的遺傳多樣性和藥材質(zhì)量研究，分析種內(nèi)和居群間的遺傳關(guān)系，揭示其遺傳豐富程度，及遺傳多樣性與藥材品質(zhì)的關(guān)系，為通關(guān)藤種質(zhì)資源保護，合理開發(fā)利用提供理論依據(jù)。另外，通過對通關(guān)藤莖和葉的轉(zhuǎn)錄組進行測序分析，發(fā)掘了大量參與通關(guān)藤皂苷生物合成的酶基因，且推測通關(guān)藤的

4、皂苷合成途徑，為利用生物技術(shù)進行化學(xué)成分調(diào)控和基因克隆提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　(1)采用文獻查閱、實地調(diào)查和關(guān)鍵人物訪談等方法，調(diào)查了通關(guān)藤在云、貴、川、廣的地理分布、生境特征、蘊藏量、生長特性等。結(jié)果顯示，通關(guān)藤主要集中分布于滇東南桂西、滇西南、黔西南三個區(qū)域，分布范圍為N21°46′～27°16′，E98°50′E～106°27′，海拔700～1700m。通關(guān)藤的生境條件一般為河谷的北岸或東岸山腰（即南坡或

5、西坡），或溫暖潮濕的山坡或山麓;多生于喀斯特地形的灌木林中，或生長于喬木植被蓋度較小的闊葉林中;通關(guān)藤對伴生植物無選擇性，攀附物主要為灌木、巖石、小喬木;對生長地的土壤性質(zhì)要求不嚴(yán)，土壤類型多為紅壤、黃壤、暗棕壤、粗骨土，質(zhì)地是壤土、砂土、砂壤。
　　(2)對不同居群通關(guān)藤種質(zhì)資源的13個表型性狀進行分析，結(jié)果表明，不同居群的通關(guān)藤的有效分枝、株高、莖粗、果實數(shù)量上存在顯著差異、具有豐富的遺傳變異，CV在13.91％～96.67％

6、。對表型性狀進行相關(guān)性分析，得出株高與莖粗、節(jié)間長、有效分枝、葉寬呈極顯著正相關(guān)，葉片長與葉寬呈極顯著正相關(guān)，其他指標(biāo)間也有一定的相關(guān)性。環(huán)境因子與表型性狀的相關(guān)性分析，得出海拔、溫度與表型性狀呈正相關(guān)，有利于通關(guān)藤生物量的積累。主成分分析結(jié)果表明葉寬、葉長、株高、莖粗、節(jié)間長為主要變異因子。
　　(3)采用簡單重復(fù)序列標(biāo)記ISSR(Inter-simple sequencer repeat)對29個野生通關(guān)藤居群進行了遺傳多樣性

7、水平和遺傳結(jié)構(gòu)的分析。結(jié)果表明，在物種水平上，多態(tài)位點百分率(PPL)為88.15％，Shannon信息指數(shù)(I)為0.4158，Nei's基因多樣性指數(shù)(He)平均為0.2768，表明在物種水平上具有較豐富的遺傳多樣性。Nei's基因分化系數(shù)(Gst)為0.4214，基因流(Nm)為0.6865，這表明居群間的遺傳變異占總變異的42.14％，而居群內(nèi)的遺傳變異為57.86％，即遺傳變異主要來源于居群內(nèi)，可能由于居群間的地理隔離和無性繁

8、殖等原因?qū)е?。采用UPGMA法及PCoA法對29個居群的通關(guān)藤進行聚類分析，結(jié)果表明通關(guān)藤居群基本按照地理、水系特征而分為三大主要類群。
　　(4)根據(jù)通關(guān)藤轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計SSR引物，對不同通關(guān)藤居群進行遺傳學(xué)分析，結(jié)果表明，在物種水平上，平均期望雜合度(E-Het)為0.4592，平均觀察雜合度(O-Het)為0.6321，O-Het略高于E-Het，說明通關(guān)藤雜合程度高。shannon多樣性指數(shù)(I)平均為0.7429，Nei

9、's基因多樣性指數(shù)(He)的分布范圍在0.2296～0.4999之間，平均He為0.458。平均多態(tài)信息含量(PIC)為0.3368，本研究的12個位點均屬中度多態(tài)性位點。Fis為-0.5542，表明群體內(nèi)雜合嚴(yán)重。Fst為-0.3412，表明群體間分化程度很小。因流(Nm）變化范圍為0.4225～6.2861，各位點基因流的差異很大，平均為2.2047。AMOVA分析結(jié)果表明引起通關(guān)藤遺傳變異的主要來源于居群內(nèi)，變異達71.05％，而

10、其居群間的變異占總變異的28.95％。對29個通關(guān)藤居群進行UPGMA聚類分析，可以將29個通關(guān)藤居群分為兩大類群。對通關(guān)藤資源進行遺傳結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明在K=2的情況下，分類效果較好，將29個群體可分為2組。EST-SSR的結(jié)果與ISSR的分析結(jié)果大致相同，但也不完全一致。
　　(5)選取ITS2、psbA-trnH、rbcL三個序列對29個居群的通關(guān)藤基因進行比較分析，結(jié)果顯示，ITS2序列有效分析長度為527 bp，G+C的

11、平均含量為58.4％，總的變異位點數(shù)(Vs)為23，其中單核苷酸變異位點(Ss)為9個，簡約信息位點(Ps)14個，單核苷酸變異位點(Ss)為9個，簡約信息位點(Ps)4個。PsbA-trnH測序得到1247bp有效全長，G+G為55.8％，有單核苷酸變異位點(Ss)為9個，簡約信息位點(Ps)7個。ITS2、psbA-trnH和rbcL序列的自展支持率(bootstrap)顯示其種內(nèi)的遺傳變異間重疊較多，不能達到區(qū)分不同居群通關(guān)藤種群

12、的目的，因此并不適合用于通關(guān)藤道地性藥材鑒別和遺傳多樣性分析。
　　(6)采用HPLC法測定不同居群通關(guān)藤藥材中綠原酸的含量，并對不同產(chǎn)地、不同生長年限、不同部位的通關(guān)藤藥材進行了質(zhì)量評價。結(jié)果表明，建立的通關(guān)藤含量測定方法經(jīng)方法學(xué)考察可靠合理;不同產(chǎn)地的通關(guān)藤綠原酸含量存在顯著差異，綠原酸的含量平均值為0.3243～1.1472％，含量較高的居群為靖西1.1472％，勐臘1.0096％，安龍0.9932％。通關(guān)藤根的綠原酸含量比

13、1、2、3年生的莖中綠原酸含量都低，根中綠原酸平均含量僅有0.2512％，通關(guān)藤1年生莖中綠原酸平均含量為0.6452％，2年生莖為0.5159％，3年及3年以上為0.3634％，由此看出，隨著通關(guān)藤年限增長，莖中綠原酸的含量逐漸減少。對通關(guān)藤綠酸的含量與環(huán)境因子進行相關(guān)性分析，結(jié)果表明通關(guān)藤綠原酸的含量與經(jīng)度、年均溫、年降水量呈正相關(guān)，而與緯度、海拔、年日照時數(shù)呈負(fù)相關(guān)。
　　(7)采用HPLC-ELSD測定不同居群通關(guān)藤藥材中

14、通關(guān)藤苷H、通關(guān)藤苷I、通關(guān)藤苷G的含量，并對不同產(chǎn)地、不同生長年限、不同部位的通關(guān)藤藥材進行了質(zhì)量評價。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地和不同年限、不同部位的通關(guān)藤苷的含量存在著較大差異。通關(guān)藤H的平均含量為0.052％，通關(guān)藤苷I的平均含量為0.098％，通關(guān)藤苷G的平均含量為0.0708％。通關(guān)藤苷H在根中的含量明顯高于莖中的含量，根的通關(guān)藤苷H平均含量為:根＞≥3年莖＞2年生莖＞1年生莖;通關(guān)藤苷I的含量表現(xiàn)為:≥3年莖＞2年生莖＞根＞1年生

15、莖，3年及3年以上通關(guān)藤莖中通關(guān)藤苷I的含量最高;通關(guān)藤苷G的平均含量表現(xiàn)規(guī)律為:2年莖＞≥3年莖＞1年莖＞根。對通關(guān)藤苷H、I、G的含量與環(huán)境因子進行相關(guān)性分析，結(jié)果表明通關(guān)藤苷H、I、G與經(jīng)度、年均溫、日照時數(shù)都呈正相關(guān)，但與海拔、年降水量呈負(fù)相關(guān)。
　　(8)建立了比色法測定通關(guān)藤中總皂苷、總酚酸、多糖的含量，并對不同產(chǎn)地、不同生長年限、不同部位的通關(guān)藤藥材的總皂苷、總酚酸、多糖含量進行了比較分析。結(jié)果表明，不同居群通關(guān)藤的

16、總皂苷、總酚酸和多糖含量差異明顯。總皂苷的含量較高的居群有云南河口8.0389％，四川德昌7.8694％，云南建水7.1739％，含量高的居群是含量低的居群的2.5倍，相差4.8306％的含量?？偡铀岷枯^高的居群是云南的華寧10.1129％，祿勸9.6767％，蒙自9.4335％，最高與最低相差3.9853％的含量，相差1.65倍。多糖的含量較高的居群有云南鎮(zhèn)康15.3441％，西疇13.6943％，廣南12.5699％。其中四川德昌

17、總皂苷含量較高，而總酚酸的含量很低，云南蒙自總酚酸的含量較高，其多糖含量就很少，因此，同一居群其化學(xué)組分也有很大差異。總皂苷的含量與生長年限呈正相關(guān)，即隨著年齡的增長，總皂苷的含量就相應(yīng)增多，而總酚酸和多糖的含量與部位、年限沒有太大密切關(guān)系。
　　(9)采用Illumina Hiseq2000高通量測序技術(shù)，從通關(guān)藤的莖和葉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得73336個contig和65796個Unigene，通過與公共數(shù)據(jù)庫的比對分析，找出27個

18、參與通關(guān)藤苷生物和孕烷苷骨架合成的Unigene。使用qRT-PCR技術(shù)分析參與通關(guān)苷生物合成的六個酶基因SQS、SQLE、CAS、4-MSO、3β-HSD、5β-POR在莖和葉中的表達情況，這6個基因在通關(guān)藤的莖和葉中都表達，CAS、SQS、SQLE、4-MSO在葉中的表達量要高于在莖中的表達量，而3β-HSD和5β-POR基因在莖中的表達量要比葉中的高，5β-POR的表達量在莖中比葉高出36.5％。另外，從11911個unigene