基于體外細(xì)胞培養(yǎng)的鼠李糖脂毒理與藥理作用研究.pdf

1、鼠李糖脂是一種生物表面活性劑，具有優(yōu)越的表/界面活性、低毒性等特點(diǎn)，在醫(yī)藥領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。美國(guó)環(huán)境保護(hù)局的報(bào)告認(rèn)為大鼠口服鼠李糖脂無(wú)毒性(LD50＞5000 mg/kg)，然而，較多文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)鼠李糖脂對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞有較大毒性。迄今為止，未見(jiàn)文獻(xiàn)解釋其大鼠口服是安全的但細(xì)胞毒性卻比較大的矛盾現(xiàn)象。因此，本文首先采用多種細(xì)胞研究鼠李糖脂細(xì)胞毒性的產(chǎn)生機(jī)理;隨后采用靜脈注射給藥的方式驗(yàn)證鼠李糖脂的體內(nèi)安全性，并分別用模擬胃液、蛋白結(jié)合和

2、基于細(xì)胞培養(yǎng)的體外代謝及吸收模型對(duì)其體內(nèi)外毒性差異的原因進(jìn)行解析。在此基礎(chǔ)上，本文進(jìn)一步采用體外細(xì)胞模型評(píng)價(jià)了其促口服吸收和抗纖維化的作用，開(kāi)展了鼠李糖脂在醫(yī)藥領(lǐng)域的潛在應(yīng)用研究。
　　首先，本文采用單層貼壁細(xì)胞對(duì)鼠李糖脂的細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并闡釋了其毒性機(jī)理。結(jié)果表明，鼠李糖脂對(duì)兩株癌細(xì)胞（HepG2和Caco-2）以及一株正常細(xì)胞系(HK-2)呈現(xiàn)類(lèi)似的毒性:無(wú)血清培養(yǎng)基中，單、雙鼠李糖脂的最小毒性濃度分別為10和20 mg/

3、L;含10％血清培養(yǎng)基中，單、雙鼠李糖脂的最小毒性濃度分別為100和150 mg/L。因此，血清能夠有效減弱鼠李糖脂的細(xì)胞毒性。本文首次發(fā)現(xiàn)，鼠李糖脂將培養(yǎng)基表面張力降低至約41 mN/m以下時(shí)產(chǎn)生細(xì)胞毒性，而血清通過(guò)減緩鼠李糖脂引起的培養(yǎng)基表面張力下降抑制其毒性。采用陰離子化學(xué)表面活性劑SDS和SDBS驗(yàn)證培養(yǎng)基表面張力與細(xì)胞毒性之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們也在溶液表面張力降至約41 mN/m以下時(shí)引起細(xì)胞毒性，說(shuō)明通過(guò)降低溶液表面張力導(dǎo)

4、致細(xì)胞毒性可能是其共同的細(xì)胞毒性機(jī)理。
　　其次，本文采用靜脈注射給藥方式驗(yàn)證了鼠李糖脂在大鼠體內(nèi)的安全性，并以體外模型解析其體內(nèi)無(wú)顯著毒性的原因。與口服相比，鼠李糖脂的靜脈注射毒性略高，在1500 mg/kg時(shí)引起輕微肝腫大和脾臟淤血，但未發(fā)現(xiàn)其它器官毒性。模擬胃酸的結(jié)果表明，鼠李糖脂在胃酸中溶解度比較低，為900 mg/L左右;平衡透析法測(cè)得鼠李糖脂的蛋白結(jié)合率為92％以上;凝膠包埋肝細(xì)胞模型預(yù)測(cè)鼠李糖脂易被肝臟代謝（肝萃取率

5、在65％左右）;小腸細(xì)胞模型揭示鼠李糖脂極易被小腸吸收（吸收率為100％）。根據(jù)以上體外模型的結(jié)果，我們推測(cè)鼠李糖脂口服安全的原因可能是:其大部分在胃酸中析出，少部分被小腸吸收進(jìn)入血液后和血漿蛋白結(jié)合，使其血液濃度較低，其易被肝臟代謝的特性又使其血液濃度進(jìn)一步降低。
　　本文還采用Caco-2細(xì)胞模型分別評(píng)價(jià)了鼠李糖脂對(duì)三條小腸吸收途徑的影響，考察其促口服吸收的作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，150 mg/L的鼠李糖脂分別提高旁路運(yùn)輸藥物（酚紅）

6、和穿細(xì)胞途徑藥物（普萘洛爾）的表觀滲透系數(shù)達(dá)7.4倍和2倍，而且可以使外排蛋白P-gp的活性下降78％。此外，還發(fā)現(xiàn)鼠李糖脂將花青素在Caco-2模型上的滲透系數(shù)提高到了1.8-2.6倍。
　　最后，本文采用體外上皮和成纖維細(xì)胞模型考察了鼠李糖脂的抗細(xì)胞纖維化作用。以TGF-β1分別誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞A549和人皮膚成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)化得到肌成纖維細(xì)胞，并評(píng)價(jià)了鼠李糖脂對(duì)肌成纖維細(xì)胞的特異性毒性。結(jié)果表明鼠李糖脂在基本不影響A549及成纖