抗乙肝病毒候選藥MCC478新酯的早期毒性研究.pdf

1、乙型病毒性肝炎,簡稱乙肝,是一種由乙型肝炎病毒(HBV)感染機體后所引起的疾病。它是一種嚴重危害人類健康的疾病,具有發(fā)病率高,人群分布廣泛,難治愈易復(fù)發(fā),易產(chǎn)生耐藥性等特點。目前,乙型肝炎的主要治療手段為藥物治療,已有的治療藥物包括天然多糖類活性物質(zhì)、干擾素(IFN)α及核苷(酸)類似物(NUCs)三大類。其中應(yīng)用最多的為核苷(酸)類似物(NUCs)。
　　現(xiàn)有的抗乙肝病毒藥核苷(酸)類似物有拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋、替諾福

2、韋酯、克拉夫定等。拉米夫定需要長期給藥,易產(chǎn)生耐藥性;阿德福韋酯最常用的抗乙肝病毒藥物,無需細胞內(nèi)磷酸化,與拉米夫定沒有交叉耐藥性,而且自身不易產(chǎn)生耐藥性;但是具有劑量限制性的腎臟毒性;替諾福韋酯是目前最有效的抗乙肝病毒藥物,在我國有專利保護,尚未在中國上市;生物利用度低,劑量較大,成本較高。阿德福韋酯及替諾福韋酯均為活潑酯前藥,進入體內(nèi)迅速在血漿中水解,化學(xué)穩(wěn)定性較差。
　　阿米福韋酯(Alamifovir,MCC478)屬于新

3、化學(xué)結(jié)構(gòu)類型的核苷酸類抗乙肝病毒新藥,在化學(xué)結(jié)構(gòu)上,與目前已知的核苷類抗乙肝藥物不同,在核苷堿基母核的6位為苯硫基取代。在抗乙肝病毒方面,該化學(xué)物對HBV具有高度選擇性的抑制作用,而對HIV、HSV等其它逆轉(zhuǎn)錄病毒沒有作用,顯示出獨特的藥理學(xué)性質(zhì);其次,它對抗拉米夫定的HBV耐藥株(YMDD變異)有效。最后,對肝臟具有高度選擇性的分布,能特異性直達靶器官,發(fā)揮藥理學(xué)作用。目前MCC478已進入Ⅱ期臨床。MCC478新酯為本所開發(fā)的MCC

4、478類似物,其抗病毒活性是MCC478的100多倍。在藥物代謝方面,MCC478新酯在體內(nèi)不形成毒性代謝中間產(chǎn)物,而是完全水解為核苷酸形式,避免了代謝中間產(chǎn)物產(chǎn)生的毒性。另外,通過形成富馬酸鹽,提高了藥物的穩(wěn)定性和水溶性。
　　MCC478新酯在藥理、藥代、藥劑以及藥效方面均優(yōu)于MCC478,那么其毒性是否也低于MCC478?是否更安全?是否能滿足毒理學(xué)的成藥條件?此即本課題所需回答的問題。
　　具體研究內(nèi)容及結(jié)果如下:首

5、先,采用Derek軟件進行計算毒理學(xué)預(yù)測分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在致癌性、抑制膽堿酯酶、神經(jīng)毒性、急性中毒性腎病、皮膚致敏、白細胞和免疫累積毒性、染色體損傷毒性方面只在代謝中間體中預(yù)測可能發(fā)生,而MCC478,MCC478新酯則不表現(xiàn)出來;在肝毒性方面,MCC478,MCC478新酯在大鼠、犬、人類中都表現(xiàn)出來,而代謝中間體預(yù)測則提示沒有肝毒性。
　　其次,體外對MCC478新酯進行細胞毒性試驗得到結(jié)果如下:MCC478新酯對HepG2細胞

6、和HK-2細胞形態(tài)的影響,對照組細胞生長狀態(tài)旺盛,伸展性良好,而給藥組發(fā)生了不同程度的細胞皺縮,細胞空泡化,死細胞增多,而且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。
　　通過MTT試驗測定MCC478新酯等對細胞增殖抑制的結(jié)果如下:MCC478新酯和MCC478能夠明顯抑制細胞的增殖,其IC50值分別為:MCC478新酯113.68μM,MCC478為638.20μM;MCC478的活性產(chǎn)物PMPA以及毒性代謝中間體單酯都能夠抑制細胞的增殖,但抑制率未

7、達到50％。因此,毒性大小順序為MCC478新酯>MCC478>單酯>PMPA。
　　其三,利用Ames波動試驗研究MCC478新酯的致突變性,結(jié)果如下:采用環(huán)磷酰胺和疊氮鈉分別作為加S9與不加S9條件下的陽性對照物,結(jié)果與溶劑對照組相比均有顯著性差異,證明本實驗系統(tǒng)真實可信。在加與不加S9的情況下,MCC478及MCC478新酯陽性孔數(shù)與對照組相比均沒有顯著性差異,提示MCC478及MCC478新酯均對TA100菌株無致突變性。

8、
　　其四,利用上下法進行體內(nèi)急性毒性研究,結(jié)果如下:阿德福韋酯經(jīng)口染毒大鼠LD50=1296mg/kg(♀),95%CI(760～2000mg/kg);MCC478新酯經(jīng)口染毒大鼠LD50>2000mg/kg(♀);根據(jù)急性毒性分級標準,均屬于低毒物質(zhì),且二者比較,MCC478新酯的LD50大于阿德福韋酯,說明MCC478新酯的急性毒性要低于阿德福韋酯。染毒后出現(xiàn)的毒性表現(xiàn)有:精神萎靡,豎毛;眼角分泌物,肛周污穢,腹瀉,角弓反張

9、。
　　最后,選擇大鼠灌胃MCC478新酯14天重復(fù)染毒毒性試驗來觀察MCC478新酯的重復(fù)給藥毒性特點。動物隨機分為溶劑對照組、MCC478新酯低劑量35mg/kg組、中劑量70mg/kg組、高劑量140mg/kg組和陽性對照阿德福韋100mg/kg組。結(jié)果發(fā)現(xiàn):隨著劑量升高,MCC478新酯動物的體重呈現(xiàn)逐漸下降趨勢,但各劑量組與對照組相比沒有顯著性差異;從整個實驗期間觀察來看,低劑量組攝食量略高于對照組,中高劑量組攝食量與對

10、照組相比則呈下降趨勢,但均無統(tǒng)計學(xué)差異,總體看來,MCC478新酯對大鼠攝食量沒有明顯的影響。
　　MCC478新酯低、中、高三個劑量組隨著劑量升高,肝臟系數(shù)呈下降趨勢,而阿德福韋酯陽性對照組的肝臟系數(shù)略高于溶劑對照組,但各給藥組間與對照組均無顯著性差異。MCC478新酯高劑量組以及陽性對照組的腎臟系數(shù)高于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。病理組織學(xué)檢查結(jié)果:MCC478新酯低劑量35mg/kg組,中劑量70mg/kg組,高劑量140m

11、g/kg組,均示腎臟結(jié)構(gòu)正常;阿德福韋100mg/kg陽性對照組,示腎近曲小管上皮細胞有輕度損傷。低劑量組35mg/kg,中劑量組70mg/kg示肝細胞和肝組織結(jié)構(gòu)正常;高劑量組140mg/kg示肝細胞腫脹等輕度損傷;陽性對照組阿德福韋100mg/kg示肝組織結(jié)構(gòu)正常.低劑量組35mg/kg,中劑量組70mg/kg,高劑量組140mg/kg示小腸結(jié)構(gòu)正常;陽性對照組阿德福韋100mg/kg示小腸粘膜層萎縮和小腸細胞損傷.淋巴組織在各劑量

12、組結(jié)構(gòu)均顯示正常。
　　綜合以上研究結(jié)果,得出以下結(jié)論:
　　1.雖然MCC478新酯急性毒性小,但高劑量組長期給藥后顯示一定的肝毒性;
　　2.采用敏感特異的的生物標志物檢測發(fā)現(xiàn),MCC478新酯可能有一定的腎毒性;3.對照藥Adefovir具有腎毒性,與國外文獻報道一致,說明此試驗系統(tǒng)可信;
　　4.MCC478和MCC478新酯在有無S9活化條件下均無致突變性;
　　5.體內(nèi)外實驗結(jié)果與毒性預(yù)測軟件的