以核糖體RNA基因間區(qū)為靶序列的物種分子生物學(xué)鑒定研究.pdf

1、核糖體RNA基因間區(qū)是研究物種分子生物學(xué)鑒定的常用重要指標(biāo)，它含量大，并且普遍存在于各種生物當(dāng)中，是物種系統(tǒng)分類學(xué)研究中最有用和最常用的靶基因序列。檢測手段的創(chuàng)新能夠迅速推動物種鑒定領(lǐng)域的發(fā)展。本文介紹了三種基于DNA水平的物種鑒定及定量的檢測方法的研究。其中兩種物種鑒定方法為食源性致病菌，分子定量方法為線蟲相關(guān)。這三種方法分別是：
　　 1）利用環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增方法特異性鑒定食品中小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的研究；
　　 2）

2、利用交叉引物方法結(jié)合免疫雜交技術(shù)快速鑒定阪崎腸桿菌的研究；
　　 3）土壤線蟲基因組DNA提取方法與分子定量方法的改進研究。
　　 1)利用環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增方法特異性鑒定食品中小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的研究
　　 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica)是30年代引起注意的急性胃腸炎型食物中毒的病原菌，為人畜共患病。該菌易染人群為嬰幼兒，常引起發(fā)熱、腹痛和帶血的腹瀉。隨著我國的快速發(fā)展，進出

3、口貨物明顯增加。而目前檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森菌仍然沿用傳統(tǒng)的生理生化方法，不僅所需時間長（約4天）而且浪費人力。這己明顯不適合我國現(xiàn)狀。用分子生物學(xué)方法檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森菌無疑是更好的選擇。在本研究中，針對16S-23S rRNA基因轉(zhuǎn)錄間區(qū)(16S-23S rRNA internal transcribed spacer，ITS)序列，本學(xué)位論文研究設(shè)計和驗證了一種環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增（loop-mediated isothermal ap

4、plificafion，LAMP）檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的方法。和PCR方法相比，該方法對實驗設(shè)備要求低，僅需要簡單操作即可高效快捷地完成。該方法靈敏度≥8CFU/ml，特異性為100％，經(jīng)大量樣品驗證，與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法一致，已成為國家進出口檢驗檢疫局新的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。
　　 2)利用交叉引物方法結(jié)合免疫雜交技術(shù)快速鑒定阪崎腸桿菌的研究
　　 阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)是一種分布極為廣泛的腸道菌

5、，特別在奶粉中的污染尤為嚴(yán)重。作為可嚴(yán)重危害生命安全的腸桿菌，由阪崎腸桿菌所引發(fā)疾病的致死病例可達40-80%以上。患者中又以嬰幼兒為眾，常常導(dǎo)致嬰兒腦膜炎、敗血癥等嚴(yán)重疾病。因此，全球范圍已經(jīng)開發(fā)了多種檢測鑒定阪崎腸桿菌的生理生化方法、PcR法以及LAMP法。但是這些方法都存在一些不足，如鑒定時間長、檢測靈敏度低，和有害試劑的使用等。本學(xué)位論文針對阪崎腸桿菌16S-23S rRNA.基因轉(zhuǎn)錄間區(qū)序列，研究設(shè)計和驗證了一種交叉引物恒溫擴

6、增(cross-primingamplification，CPA)與免疫雜交分析技術(shù)(immuno blotting)相結(jié)合的阪崎腸桿菌鑒定方法。并且同時進行了國家出入境檢驗檢疫局行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的阪崎腸桿菌PcR鑒定實驗，作為CPA檢測結(jié)果特異性與靈敏度的對照。結(jié)果表明，該CPA方法靈敏度為≥lOfg DNA或≥12CFU/ml，特異性為100%，與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法完全一致。而且，擴增產(chǎn)物檢測只需要免疫雜交試紙條，在5-10min內(nèi)便可以知道結(jié)果

7、。因此，該方法更適應(yīng)于野外以及現(xiàn)場樣品的檢測。
　　 3)土壤線蟲基因組DNA提取方法與分子定量方法的改進研究
　　 線蟲( nematode)是一種在地球上存在數(shù)量極為巨大的多細(xì)胞真核生物。尤其在土壤中行使著各種不同的重要作用，對生態(tài)系統(tǒng)和碳元的代謝有著極為重要的作用。在這些線蟲中存在著一大類植物寄生性線蟲，它們可以導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)，全球平均每年造成157億美元的損失。因此，對土壤線蟲種類的鑒定就變得尤為重要。然而，雖然

8、線蟲具有如此重要的作用，但是目前常用的線蟲鑒定方法仍舊是顯微鏡下線蟲形態(tài)觀察鑒定方法。該方法不僅需要消耗大量時間而且鑒定過程中需要使用多種對人身體健康有害的試劑。因此，最近許多研究報道提出以分子生物學(xué)鑒定方法替代形態(tài)學(xué)鑒定。但是，為了進行分子生物學(xué)鑒定的基因克隆測序，便需要PCR產(chǎn)生大量擴增產(chǎn)物。因此，也就對線蟲基因組DNA的提取方法有了較高的要求。本實驗通過針對秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）和昆蟲病原性線

9、蟲（Steinernema carpocapse）18S-28SrRNA基因轉(zhuǎn)錄間區(qū)序列，對現(xiàn)有的三種線蟲基因組DNA提取方法（酚-仿法、氫氧化鈉法、吐溫20法）進行比較，并提出了一種全新的改進方法(Triton X-100法)。結(jié)果表明，在三種現(xiàn)在常用的線蟲基因組DNA提取方法中，酚-仿法不適合進行少量線蟲的基因組DNA提取，氫氧化鈉法提取基因組模板PCR擴增量明顯低于吐溫20法，吐溫20法是三種方法中線蟲基因組DNA擴增產(chǎn)量最高也是

10、最穩(wěn)定的方法。但是，三種常用提取方法的PCR產(chǎn)物擴增量均無法達到TritonX-l00提取方法的水平。因此，Triton X-l00線蟲基因組DNA改進提取方法更適合線蟲基因的擴增，更能夠保證克隆測序的順利進行。
　　 根結(jié)線蟲(root-knot nematodes)被認(rèn)為是導(dǎo)致農(nóng)業(yè)損失最嚴(yán)重的一種線蟲。它通過寄生于植物的根系阻斷植物根系對土壤中水和養(yǎng)料的攝取，從而導(dǎo)致農(nóng)作物畝產(chǎn)量的嚴(yán)重降低。以南方根結(jié)線蟲(Meloidogy

11、ne spp.RKN)為例，它被認(rèn)為是植物“零承受”的土壤線蟲，因為，南方根結(jié)線蟲將嚴(yán)重影響農(nóng)作物的生長。每1000毫升土壤中，只要存在一條南方根結(jié)線蟲都將會嚴(yán)重降低農(nóng)作物的產(chǎn)量。因此，能夠準(zhǔn)確計算出土壤中南方根結(jié)線蟲數(shù)量，就成為治理南方根結(jié)線蟲的首要條件。分子生物學(xué)方法主要依靠熒光定量PCR技術(shù)，通過計算熒光激發(fā)的循環(huán)值(cycle-threshold，Ct)對檢測樣品進行分子定量。但是，由于目前采用Ct值方法對樣品進行定量分析時，普