細(xì)胞周期末期促進(jìn)復(fù)合物及其調(diào)節(jié)亞基Cdh1在缺血性腦損傷中的作用及機(jī)制.pdf

1、研究背景和目的:
　　 近年來(lái)，伴隨著臨床急救水平的進(jìn)一步提高，很多心肺復(fù)蘇、心肌梗塞、窒息、休克等危重病人搶救成功率逐漸提高，而這些疾病所造成的全腦缺血損傷以及缺血再灌注后損傷已成為研究熱點(diǎn)。其中，腦缺血及再灌注后如何減少神經(jīng)元死亡一直是臨床研究的難點(diǎn)。大量學(xué)者經(jīng)過(guò)一系列腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ脱芯浚謩e從形態(tài)學(xué)、生化等多角度證實(shí)凋亡存在于腦缺血再灌注損傷中。因此，研究如何有效抑制凋亡是減輕腦缺血再灌注損傷的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。
　　

2、 研究認(rèn)為，Cdh1為細(xì)胞周期末期促進(jìn)復(fù)合物(anaphase promoting complex，APC)的調(diào)節(jié)亞基之一，發(fā)現(xiàn)在增殖細(xì)胞中，其起到調(diào)控細(xì)胞周期的作用，是通過(guò)泛素化降解特定的底物蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)的。隨著最近一些年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，Cdh1在成熟神經(jīng)元中有大量表達(dá)，并且具有調(diào)節(jié)突觸傳遞、神經(jīng)元存活以及神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)等的作用。然而，目前尚不清楚關(guān)于APC-Cdh1在神經(jīng)損傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)其他方面的作用。Almeida等研究發(fā)現(xiàn)APC-

3、Cdh1具有抑制神經(jīng)元凋亡的作用。推測(cè)APC-Cdh1的活性降低與Cyclin B的異常積聚可能是阿爾茨海默病及其他神經(jīng)退行性疾病中神經(jīng)元凋亡的機(jī)制之一。當(dāng)前，在我國(guó)國(guó)內(nèi)關(guān)于細(xì)胞周期末期促進(jìn)復(fù)合物(anaphase promoting complex，APC)之調(diào)節(jié)亞基Cdh1在腦缺血再灌注損傷中的表達(dá)變化，以及對(duì)APC-Cdh1的表達(dá)進(jìn)行干預(yù)在腦缺血再灌注損傷中的作用以及機(jī)制的研究還很少。
　　 本研究將首先通過(guò)建立大鼠全腦缺

4、血再灌注損傷模型，探討腦缺血再灌注損傷后APC-Cdh1的表達(dá)變化與神經(jīng)元凋亡及神經(jīng)功能改變的關(guān)系。然后通過(guò)下調(diào)APC-Cdh1活性，實(shí)現(xiàn)對(duì)腦缺血后神經(jīng)元凋亡的影響，從在體實(shí)驗(yàn)的角度探討APC-Cdh1在缺血性腦損傷中的作用及機(jī)制。繼而為選擇APC-Cdh1作為腦保護(hù)新策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　
　　 研究方法與結(jié)果1.大鼠全腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元凋亡及認(rèn)知功能的研究方法：取健康成年雄性SD大鼠80只，體重260～30

5、0g，隨機(jī)分成假手術(shù)組（SH組）、缺血再灌注組（IR組），每組各40只。根據(jù)再灌注的不同時(shí)間點(diǎn)分為1d、3d、7d三個(gè)亞組。假手術(shù)組只電凝椎動(dòng)脈而不結(jié)扎兩側(cè)頸總動(dòng)脈，缺血再灌注組采用改良4-VO法建立大鼠全腦缺血再灌注損傷模型，缺血時(shí)間為7min。根據(jù)分組于不同時(shí)間點(diǎn)取大鼠腦部制作冰凍切片，尼氏染色觀察海馬神經(jīng)元的形態(tài)和海馬神經(jīng)元的存活情況，TUNEL法檢測(cè)海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞，分別計(jì)算神經(jīng)元密度和凋亡指數(shù)。兩組大鼠建立模型后第七天后開

6、始，進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。
　　 結(jié)果：尼氏染色顯示，假手術(shù)組海馬神經(jīng)元藍(lán)染，細(xì)胞排列整齊，海馬形態(tài)完整，CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞4～5層，排列整齊、細(xì)胞核大而圓，核仁清楚，亞甲胺藍(lán)染色顯示尼氏體豐富。缺血再灌注組第1d、3d、7d亞組海馬CA1區(qū)可見神經(jīng)細(xì)胞脫失明顯，排列紊亂，胞體形狀不規(guī)則。尼氏體減少甚至消失、核變小、深染固縮。與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度顯著下降（p<0.05）；TUN

7、EL法檢測(cè)顯示，假手術(shù)組海馬區(qū)偶見凋亡神經(jīng)元。缺血再灌注組第1d、3d、7d亞組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元大量凋亡。與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組第1，3，7天亞組凋亡指數(shù)明顯增加，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。Morris水迷宮檢測(cè)：Morris水迷宮檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組大鼠訓(xùn)練階段第2—4天的尋臺(tái)時(shí)間明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而第五天的記憶測(cè)試尋臺(tái)潛伏期也明顯長(zhǎng)于假手術(shù)組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜

8、0.01）。
　　 2.大鼠全腦缺血再灌注損傷后APC-Cdh1的表達(dá)變化方法：健康雄性SD大鼠60只，體重260～300g，隨機(jī)分成假手術(shù)組（SH組）、模型組（IR組）。根據(jù)再灌注的不同時(shí)間點(diǎn)分為1d、3d、7d三個(gè)亞組。模型組采用改良4-VO法建立SD大鼠全腦缺血再灌注損傷模型，假手術(shù)組只電凝椎動(dòng)脈而不結(jié)扎兩側(cè)頸總動(dòng)脈，缺血時(shí)間為7min。根據(jù)分組在損傷后不同時(shí)間點(diǎn)，取大鼠腦部制作冰凍切片，免疫組化染色檢測(cè)Cdh1的表達(dá)部位

9、并且采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)大鼠海馬組織APC-Cdh1mRNA的表達(dá)以及采用Western Blot 檢測(cè)大鼠海馬組織APC-Cdh1蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：免疫組化檢測(cè)顯示APC-Cdh1在海馬區(qū)及皮層區(qū)中均有大量表達(dá)。熒光定量PCR顯示，對(duì)照組中，術(shù)后不同時(shí)點(diǎn)Cdh1mRNA表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)；與對(duì)照組比較，模型組第1d 亞組Cdh1mRNA表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），第3d亞組

10、及第7d 亞組Cdh1mRNA表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組中，與第1d亞組比較，第3d亞組Cdh1mRNA表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與第3d亞組比較，第7d亞組Cdh1mRNA表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Western Blot顯示，與對(duì)照組相比，缺血再灌注組術(shù)后第1d組 APC-Cdh1蛋白表達(dá)減少，術(shù)后第3d 顯著升高，術(shù)后7d又降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。

11、　　
　　 3.慢病毒介導(dǎo)的Cdh1-siRNA在大鼠腦缺血再灌注損傷后的表達(dá)及功能方法：150只雄性SD大鼠，體重260～300g，隨機(jī)分成生理鹽水組（A組，n=50）、空慢病毒組（B組，n=50）和重組慢病毒（C組，n=50），三組分別注射生理鹽水、空慢病毒和重組慢病毒。藥物注射3天后，各組大鼠均采用改良4-VO法建立SD大鼠全腦缺血模型，缺血時(shí)間為7min。建立模型七天后取大鼠腦部制作冰凍切片，以及取大鼠海馬組織，分別

12、用熒光定量PCR檢測(cè)海馬組織Cdh1mRNA表達(dá)和Western Blot檢測(cè)Cyclin B的變化。TUNEL法檢測(cè)海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞，計(jì)算各組大鼠的凋亡指數(shù)。建立模型七天后，三組大鼠進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能的變化。
　　 結(jié)果：熒光定量PCR顯示，與A組和B組比較，C組的Cdh1mRNA表達(dá)明降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Western Blot顯示，與A組和B組比較，C組Cyclin B的表

13、達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TUNEL法檢測(cè)顯示：與A組和B組比較，C組凋亡指數(shù)顯著增加（P＜0.05）。Morris水迷宮檢測(cè)顯示，與A組和B組比較，C組大鼠學(xué)習(xí)階段即第一天至第四天大鼠尋臺(tái)時(shí)間明顯延長(zhǎng)，而其記憶測(cè)試潛伏期也明顯長(zhǎng)于A組或B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　
　　 研究結(jié)論
　　 1.成功地構(gòu)建了全腦缺血再灌注損傷模型。采用改良4-VO法建立SD大鼠全腦缺血再灌注損傷

14、模型后海馬神經(jīng)元凋亡顯著增加，認(rèn)知功能明顯下降。
　　 2.APC-Cdh1在大鼠正常腦組織以及全腦缺血再灌注損傷后有大量表達(dá)。而且，大鼠全腦缺血再灌注損傷后，在各不同的時(shí)點(diǎn)，大鼠腦組織中APC-Cdh1的表達(dá)明顯增高。推測(cè)APC-Cdh1可能與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷有著密切的關(guān)系，參與全腦缺血再灌注損傷的病理生理過(guò)程。
　　 3.大鼠海馬組織注射慢病毒介導(dǎo)的Cdh1RNA干擾后，下調(diào)了Cdh1的表達(dá)，大鼠全腦缺血再灌注

15、損傷后大鼠海馬組織Cyclin B的表達(dá)明顯增高。APC-Cdh1可能是通過(guò)Cyclin B堆積介導(dǎo)缺血性神經(jīng)元凋亡的。
　　
　　 研究總結(jié)
　　
　　 本課題首先通過(guò)建立改良4-VO全腦缺血再灌注損傷模型，揭示了全腦缺血再灌注后對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元造成損傷，海馬神經(jīng)元出現(xiàn)遲發(fā)性死亡，大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力下降，認(rèn)知功能明顯降低。然后在建立大鼠全腦缺血再灌注后，發(fā)現(xiàn)的大鼠海馬區(qū)APC-Cdh1的表達(dá)升高。提

16、示APC-Cdh1可能參與全腦缺血再灌注損傷等病理生理過(guò)程。然后通過(guò)腦立體定向注射Cdh1RNA干擾慢病毒載體至大鼠的海馬后，在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)建立改良4-VO全腦缺血再灌注損傷模型。觀察慢病毒介導(dǎo)的Cdh1RNA干擾對(duì)全腦缺血再灌注損傷的影響，發(fā)現(xiàn)Cdh1的表達(dá)下調(diào)，Cyclin B表達(dá)升高，大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力下降，認(rèn)知功能明顯降低。本實(shí)驗(yàn)初步研究了APC-Cdh1在全腦缺血再灌注后在腦組織中的表達(dá)特點(diǎn)，以及全腦缺血再灌注后的作用。進(jìn)一步