異種半月板移植形態(tài)學的可行性實驗研究.pdf

1、研究背景及目的: 半月板是介于股骨髁和脛骨平臺之間的半月狀纖維軟骨組織。在臨床工作中,半月板的損傷十分常見。半月板有自我愈合能力,不幸的是這種能力僅限于半月板的血管區(qū)。對于血管區(qū)外的損傷及退變,既往半月板損傷后均以半月板部分切除或全部切除的方法進行治療。多個研究結(jié)果表明：半月板切除后常不可避免引起關(guān)節(jié)退變,骨關(guān)節(jié)炎的病變程度與半月板切除的量成正比。故半月板損傷的治療方法從早期的全部切除,到后來發(fā)展出各種各樣的修復方法,包括縫合法

2、,半月板箭,纖維蛋白粘合,激光焊接,以及各種增加半月板血供的術(shù)式等。由于各種方法均有不同的缺陷,且只有半月板的有血供區(qū)才能有效地修復,對于半月板無血供區(qū),目前仍以關(guān)節(jié)鏡下半月板部分和全部切除為主,于是半月板移植術(shù)成為解決半月板損傷的新方案。 從1916年當時Lexer首次試用自體脂肪組織充填關(guān)節(jié)間隙,成為半月板置換術(shù)發(fā)展的皺形到目前半月板移植已有近一個世紀的歷史,但半月板移植只在近二十年有了較大的進展。1984年,Milacho

3、wsk和Wirth進行了第一例游離半月板移植。目前,同種異體半月板移植作為國際上已經(jīng)比較成熟的手術(shù)方式,其臨床療效和預后已經(jīng)被證實。但由于同種異體半月板的來源非常有限,而為了更好地使供體半月板匹配受體關(guān)節(jié)內(nèi)的其它結(jié)構(gòu),往往要在幾個或十個半月板中才能找到一個和受體匹配的移植體,這樣就使得同種異體半月板移植技術(shù)在推廣和普及方面的障礙較大。 如果可以找到另外一種比同種異體半月板更容易獲得的材料,并且,這種材料與半月板的基質(zhì)也具有高度的

4、同源性,其形狀也能與關(guān)節(jié)內(nèi)的其它結(jié)構(gòu)相匹配,這樣的材料就能滿足半月板移植供體的需要。異種半月板正好具有上述的優(yōu)點。而且可以避免疾病傳播及倫理學學等問題,并其取材容易。作為哺乳類動物的豬膠原基因,它和人類膠原基因具有高度的同源性,而構(gòu)成基因的大分子物質(zhì)結(jié)構(gòu)也相差無幾,正好滿足了作為支架的一個條件,如能夠?qū)⑦@樣的支架朔形成與受體半月板完全匹配的形狀就應(yīng)該可以得到一個滿意的結(jié)果。 在本實驗研究中,為了全面系統(tǒng)地對正常成人半月板與成年豬

5、半月板的形態(tài)學進行比較,進行了以下研究： 實驗方法與結(jié)果: 第一部分：成人半月板與豬異種半月板解剖學測量與比較 方法：取離體缺血小于1小時新鮮無任何病變的成人膝關(guān)節(jié)21例,左側(cè)(8例)、右側(cè)(13例)及新鮮處死30分鐘以內(nèi)的檢疫生豬(體重90-120KG)膝關(guān)節(jié)33例,左側(cè)(20例)、右側(cè)(13例);范圍：一個完整膝關(guān)節(jié)包括膝關(guān)節(jié)髕骨上極以上10厘米,脛骨結(jié)節(jié)以下10厘米。將膝關(guān)節(jié)周圍的肌肉韌帶等軟組織給予剔除,

6、進行半月板的大體觀察。游離取下半月板,采用游標卡尺進行測量。 結(jié)果：豬半月板與人半月板外形基本相似,外側(cè)半月板呈近似“0”形,而內(nèi)側(cè)半月板呈"C"形,半月板的結(jié)構(gòu)可以概括為“三面一緣”：即與股骨髁相關(guān)的凹形的上表面,與脛骨平臺相關(guān)的下表面,借冠狀韌帶與關(guān)節(jié)囊和脛骨平臺相連的周圍面以及位于關(guān)節(jié)腔中央呈弧型的游離緣。與人半月板前后角止于脛骨平臺不同的是,豬外側(cè)半月板后角止于股骨后髁,測量半月板大小的兩項主要指標：最大矢狀徑、最大橫徑

7、。人內(nèi)側(cè)半月板的最大矢狀徑、最大橫徑均比外側(cè)半月板大,而豬外側(cè)半月板最大矢狀徑、最大橫徑均比內(nèi)側(cè)半月板大。除此之外,豬內(nèi)外側(cè)半月板前角、體部、體部中點、后角外緣厚度明顯大于相應(yīng)的人半月板,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),豬內(nèi)側(cè)半月板的前角、體部、后角寬度無顯著差異(P>0.05),而外側(cè)半月板具有顯著差異(P<0.05)。 第二部分：成人半月板與豬異種半月板組織形態(tài)學的比較 方法：取新鮮人和豬半月板組織各6個,10％福

8、爾馬林固定,經(jīng)脫鈣,脫水、透明、石蠟包埋,用組織切片機進行5um厚度的連續(xù)切片,按常規(guī)方法對切片進行HE和甲苯胺藍染色,同時用I、II型膠原單克隆抗體對切片進行免疫組織化學染色,并進行光鏡觀察。 結(jié)果：人半月板HE染色觀察見有大量平行或交叉排列的膠原纖維束。半月板纖維軟骨細胞分布于纖維束間,或單獨存在,或成對存在,或排列成單行。甲苯胺藍染色見纖維軟骨細胞位于陷窩內(nèi),軟骨細胞的大小、形狀、及分布特點在纖維軟骨內(nèi)有一定的規(guī)律,細胞周

9、圍基質(zhì)染色為藍色。I、II型膠原單克隆抗體對切片進行免疫組織化學染色均為強陽性。豬半月板HE染色見膠原纖維成束狀、弧形排列,也有少量膠原纖維成放射狀排列,纖維軟骨細胞三五成群的位于膠原纖維構(gòu)成的網(wǎng)中。甲苯胺藍染色見纖維軟骨細胞位于陷窩內(nèi),呈圓形、橢圓型或梭形,半月板纖維軟骨細胞周圍基質(zhì)染色為藍色,細胞周圍有異染基質(zhì)。I、II型膠原單克隆抗體對切片進行免疫組織化學染色,I、II型膠原均為陽性。豬半月板與人半月板相比,在組織形態(tài)學方面的差別

10、無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。組織形態(tài)學觀察表明,豬半月板具有與人相同或相似的組織形態(tài)學結(jié)構(gòu),豬半月板纖維軟骨細胞能夠分泌細胞外基質(zhì)。 第三部分：成人半月板與豬異種半月板組織超微結(jié)構(gòu)的比較 方法：取新鮮人與豬半月板組織(離體小于30分鐘)各7個,PBS沖洗半月板,清除血漬。3％戊二醛固定,梯度酒精脫水,環(huán)氧樹脂包埋,超薄切片,鈾鉛雙重染色,透射電鏡觀察下觀察半月板纖維軟骨細胞超微結(jié)構(gòu)并攝影。另取新鮮半月板組織,PBS沖洗

11、半月板,清除血漬。3％戊二醛固定,梯度酒精、丙酮脫水,臨界點干燥,鍍金,掃描電鏡觀察半月板結(jié)構(gòu)并攝影。 結(jié)果：人半月板透射電鏡觀察見纖維軟骨細胞表面有突起和鄒褶,胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富,高爾基復合體發(fā)達,并可見顆粒狀和細絲狀分泌物質(zhì),見少量脂滴。掃描電鏡見半月板表面呈波浪狀,峰與溝交錯而成,大量平行或交叉排列的膠原纖維束,不同部位其膠原纖維排列方式有不同。豬半月板透射電鏡觀察見半月板纖維軟骨細胞圓形或橢圓形,表面有嵴狀突起,并伸向