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1、第一部分人熱休克蛋白70腺病毒載體的構(gòu)建 目的:構(gòu)建人熱休克蛋白70(HSP70)重組腺病毒(AD)載體(AD5-HSP70)。 方法: 通過(guò)質(zhì)粒提取、測(cè)序鑒定HSP70,利用細(xì)菌內(nèi)質(zhì)粒間同源重組法構(gòu)建AD5-HSP70。 結(jié)果: 成功獲取HSP70后,利用細(xì)菌內(nèi)質(zhì)粒間同源重組法成功復(fù)制缺陷重組腺病毒載體AD5-HSP70。 結(jié)論: 本研究證實(shí)利用細(xì)菌內(nèi)同源重組法成功構(gòu)建腺病毒載
2、體AD5-HSP70并通過(guò)測(cè)序,為進(jìn)一步研究HSP70的基因治療奠定了基礎(chǔ)。 第二部分改良Heron法建立頸部異位心臟移植模型 目的: 對(duì)Heron法進(jìn)行部分改進(jìn),建立簡(jiǎn)化的wistar-SD大鼠頸部異位心臟移植模型。 方法: 采用改進(jìn)的套管技術(shù)通過(guò)自制Cuff管將wistar大鼠供心的升主動(dòng)脈、肺動(dòng)脈與SD大鼠受體的右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外靜脈分別進(jìn)行吻合連接。 結(jié)果: 單人操作連續(xù)進(jìn)
3、行正式試驗(yàn)24例,成功率100%,無(wú)吻合口漏血或血管回流受阻,移植物復(fù)跳率100%。總手術(shù)時(shí)間45~60min,吻合時(shí)間3~5min,供心冷缺血平均15min。 結(jié)論: 改良Heron法建立大鼠頸部異種心臟移植無(wú)需顯微外科操作,是一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、穩(wěn)定可靠和易于復(fù)制的器官移植研究動(dòng)物模型。 第三部分轉(zhuǎn)染人熱休克蛋白70對(duì)同種異體移植心臟移植物血管病的影響 目的: 建立頸部心臟移植模型,研究經(jīng)冠狀
4、動(dòng)脈內(nèi)灌注重組腺病毒載體介導(dǎo)HSP70(Ad.HSP70)轉(zhuǎn)基因治療對(duì)同種異體心臟移植物血管病的影響,并探討同種移植的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)。 方法: 以套管技術(shù)建立頸部異位異種心臟移植模型,wistar大鼠供心切取后,基因轉(zhuǎn)移組在體外經(jīng)冠狀動(dòng)脈緩慢灌注含3.8 × 10VP/mL Ad-HSP70的4℃HTK液,持續(xù)45min,再植入SD大鼠受體頸部(3組)??瞻纵d體組灌注含3.8×1010VP/mL不攜帶的基因腺病毒空白載體(
5、Ad)的HTK液(2組),對(duì)照組僅灌注無(wú)病毒的HTK液(1組)持續(xù)同樣時(shí)間。術(shù)后1月收集移植物組織作檢測(cè)。組織內(nèi)目的基因表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)免疫分析、RT-PCR進(jìn)行半定量分析,免疫組化染色進(jìn)行定性和定位分析。 結(jié)果: RT-PCR證實(shí)移植物內(nèi)外源性HSP70基因轉(zhuǎn)錄,免疫組化檢測(cè)證實(shí)Ad.HSP70轉(zhuǎn)染的移植物(3組)HSP70成功轉(zhuǎn)到血管周?chē)男募〖?xì)胞和冠狀動(dòng)脈微血管,HSP70表達(dá)水平明顯高于其他兩組(P<0.01)。HS
6、P70過(guò)量表達(dá)能夠增加BCL-2表達(dá)及減少NF-K B的活化以及VCAM-1的表達(dá),HSP70過(guò)量表達(dá)的移植物內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)明顯減少,巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞浸潤(rùn)減少,移植物血管內(nèi)皮損傷輕。 結(jié)論: 本研究證實(shí),經(jīng)冠狀動(dòng)脈灌注重組腺病毒載體介導(dǎo)保護(hù)性自穩(wěn)蛋白一人熱休克蛋白70基因轉(zhuǎn)移到心臟移植物是相當(dāng)有效可行的,并減輕移植物冠脈內(nèi)皮損傷,預(yù)防移植物血管病。經(jīng)冠狀動(dòng)脈灌注重組腺病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移在移植物內(nèi)局部表達(dá)有潛力的治療
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