定點(diǎn)生物素修飾雙價(jià)抗PTH納米抗體及吸附劑的制備.pdf

1、甲狀旁腺激素（parathyroid hormone, PTH）是終末期慢性腎臟病患者體內(nèi)大量蓄積的中分子毒素之一，體內(nèi)過(guò)多的PTH導(dǎo)致繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)，造成多系統(tǒng)病變，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量與生存率。而目前的血液透析方法，無(wú)法去除體內(nèi)過(guò)多的PTH，因此急需能夠特異性吸附 PTH的血液凈化材料。納米抗體具有易于改造、親和力高、血液相容性好等優(yōu)點(diǎn)，是制作血液凈化吸附劑的理想配基。此外，通過(guò)對(duì)納米抗體進(jìn)行串聯(lián)改造，能夠顯著提高其生物學(xué)

2、性能。而鏈霉親和素與生物素系統(tǒng)是蛋白固載中常用的定向固載方法，能夠更好的保持蛋白活性。本論文將二者相結(jié)合，利用鏈霉親和素與生物素系統(tǒng)，以雙價(jià)抗PTH納米抗體為配基，制備PTH血液凈化吸附劑，并對(duì)其應(yīng)用于PTH的血液凈化進(jìn)行了可行性研究。具體內(nèi)容如下：
　?。?）雙價(jià)定點(diǎn)生物素修飾抗PTH納米抗體的制備。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)室篩選的5種抗PTH納米抗體進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，選取只有一對(duì)Cys的2種序列構(gòu)建帶有生物素修飾標(biāo)簽(avi-tag)的雙價(jià)抗P

3、TH納米抗體Nb1-Nb2，并以單價(jià)抗PTH納米抗體Nb1為對(duì)照進(jìn)行相同的基因工程改造；改造后的納米抗體載體轉(zhuǎn)化入3種大腸桿菌中，經(jīng)篩選，最終選取可溶表達(dá)效果最好的E.coli S huffle T7進(jìn)行表達(dá)；固定化金屬離子親和層析純化后，獲得了純度85%以上、終產(chǎn)量100 mg/L左右的兩種抗體。Biaco re測(cè)定兩種納米抗體親和力，發(fā)現(xiàn)Nb1-Nb2較Nb1親和力提高了6.2倍，Kd達(dá)到了3.757×10-7 M。在生物素連接酶的

4、作用下，帶有avi-tag的2種納米抗體在體外可以實(shí)現(xiàn)80%的生物素修飾。
　　（2）鏈霉親和素的制備。鏈霉親和素質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli S huffle T7中，可進(jìn)行可溶表達(dá)，通過(guò)鎳離子親和層析純化，得到純度高達(dá)95%的鏈霉親和素。利用233 nm紫外光譜法測(cè)定鏈霉親和素活性為12.5 U/mg，具備很高的生物素結(jié)合活性。
　　（3）血液凈化吸附劑的制備及吸附性能評(píng)價(jià)。通過(guò)鏈霉親和素-生物素技術(shù)成功在瓊脂糖凝膠上定向偶聯(lián)了