致病抗體血液凈化吸附劑的合成及性能研究.pdf

1、用于血液凈化治療自身免疫性疾病的蛋白A吸附柱屬于三類醫(yī)療器械，其內(nèi)部填充的蛋白A吸附劑能夠快速、有效地吸附清除患者血液中的致病抗體和免疫復(fù)合物，實(shí)現(xiàn)救治病人的目的，其臨床效果已得到醫(yī)生和病人的廣泛認(rèn)可。由于作為吸附劑關(guān)鍵功能基的基因工程蛋白A存在售價(jià)昂貴、不易保存和消毒等缺陷，導(dǎo)致蛋白A吸附柱的臨床應(yīng)用受限。本論文的主要研究內(nèi)容包括以下3個(gè)方面：(1)計(jì)算機(jī)分子模擬固定化配基與血漿中高豐度蛋白的結(jié)合，旨在有目的的篩選可能替代蛋白A的小分

2、子功能基；(2)在分子模擬的基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)篩選對(duì)IgG具有選擇性吸附能力的小分子功能基，優(yōu)化吸附劑的合成并對(duì)其吸附性能進(jìn)行評(píng)價(jià)；(3)研究篩選出的小分子功能基吸附劑對(duì)血漿中致病因子的清除能力及其安全性，并與商業(yè)化的蛋白A吸附劑進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)其取代蛋白A吸附劑進(jìn)行血液凈化治療的可行性。 論文首先利用分子模擬軟件DOCK5.0模擬了固定化配基與血漿中的兩種高豐度蛋白質(zhì)IgG及HSA的表面作用特征，分析了兩種蛋白質(zhì)表面疏水區(qū)域的分布特點(diǎn)

3、。分析結(jié)果表明，IgG表面的疏水區(qū)域與HSA相比差異很大，IgG表面的疏水位點(diǎn)較多并相對(duì)分散，疏水口袋較淺，固定化配基可接觸程度較高；而HSA表面的疏水位點(diǎn)相對(duì)集中，疏水口袋較深，固定化配基可接觸程度較低。根據(jù)上述兩種蛋白質(zhì)的表面特點(diǎn)，確認(rèn)選擇固定化疏水配基有可能實(shí)現(xiàn)對(duì)IgG的選擇性吸附。 在上述研究基礎(chǔ)上，選擇了16種帶有不同疏水特性的小分子化合物為配基合成吸附劑，利用IgG和HSA為樣本評(píng)價(jià)了其對(duì)IgG的選擇性吸附能力，發(fā)現(xiàn)

4、，兼具疏水性和富電子特性的功能基對(duì)IgG的選擇性吸附能力遠(yuǎn)高于HSA。進(jìn)一步利用血清樣本評(píng)價(jià)其在復(fù)雜樣本中的選擇吸附特性，結(jié)果表明4-巰基乙基吡啶(MEP)吸附劑效果最佳。 吸附劑采用SepharoseCL-6B為載體，溴丙烯活化、N-溴代丁二酰亞胺溴化的方法偶聯(lián)MEP，以對(duì)血清中IgG具有較高吸附容量同時(shí)非特異吸附較低為目標(biāo)，優(yōu)化了MEP吸附劑的合成條件，較優(yōu)化的合成條件為：SepharoseCL-6B在1.2mol/LNaO

5、H溶液中(凝膠與溶液體積比為1:1)經(jīng)20％溴丙烯(相對(duì)于凝膠的體積比)活化反應(yīng)4h；帶有烯丙基活性基團(tuán)的SepharoseCL-6B經(jīng)N-溴代丁二酰亞胺溴化后，在pH10的溶液條件下偶聯(lián)MEP分子。上述反應(yīng)條件可控制吸附劑的配基密度在100-150μmol/mLgel，對(duì)IgG的動(dòng)態(tài)結(jié)合容量為36.21mg/mL，對(duì)人血漿中抗體組分的吸附容量約為30mg/mL，占其血漿蛋白吸附總量的85％以上，其抗體結(jié)合能力和選擇性能夠滿足血液凈化吸

6、附劑的要求。 對(duì)MEP吸附劑清除自身免疫性疾病病人血清中致病因子的能力進(jìn)行了系統(tǒng)研究。對(duì)于分子大小差異較大的致病因子，不同固定化密度的MEP吸附劑對(duì)其清除能力呈現(xiàn)出不同的規(guī)律。對(duì)于分子量近900KDa的類風(fēng)濕因子，當(dāng)固定化MEP密度達(dá)到60μmol/mLgel時(shí)，對(duì)其清除能力達(dá)到95％以上，而對(duì)于系統(tǒng)性紅斑狼瘡的致病因子抗雙鏈DNA抗體，隨著固定化MEP密度的升高，病人血漿中抗雙鏈DNA抗體的去除率升高，當(dāng)固定化MEP密度達(dá)到1

7、00μmol/mLgel時(shí)，抗雙鏈DNA抗體的去除率達(dá)到85％。進(jìn)一步利用采自不同病人的樣本考察了MEP吸附劑對(duì)類風(fēng)濕和系統(tǒng)性紅斑狼瘡中致病因子清除的個(gè)體差異，并與商品化的ProteinA吸附劑進(jìn)行比較。研究結(jié)果表明：MEP吸附劑對(duì)類風(fēng)濕因子的清除率達(dá)到90％以上，其中陰性率為75％，基本沒有個(gè)體差異；而商品化的蛋白A吸附劑吸附后的陰性率僅為10％，大部分的清除率在12％至83％之間，個(gè)體差異明顯。但對(duì)于系統(tǒng)性紅斑狼瘡的致病因子抗核抗體

8、，MEP吸附劑的清除有效率為78％，商品化蛋白A清除有效率為57％，個(gè)體差異均較大。在總的致病因子清除效果方面，MEP吸附劑優(yōu)于商品化的蛋白A吸附劑。 論文進(jìn)一步研究了MEP吸附劑的生物安全性，吸附劑浸出液的小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)表明，MEP吸附劑的浸出液未對(duì)小鼠產(chǎn)生毒性，說明其中沒有有毒物質(zhì)脫落。對(duì)狗進(jìn)行的MEP吸附劑吸附實(shí)驗(yàn)表明，利用該產(chǎn)品的治療過程安全可靠。 上述研究結(jié)果證實(shí)，MEP吸附劑對(duì)病人血漿中的致病因子具有較高的