基于GC-MS的代謝組學技術(shù)對急性百草枯中毒大鼠的血漿代謝組學研究.pdf

1、目的：本實驗通過基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)的代謝組學研究百草枯中毒后大鼠的血漿代謝組學，觀察急性百草枯中毒后不同時間段大鼠的一般情況。通過多種多元統(tǒng)計分析方法分析血漿代謝組學數(shù)據(jù)，篩選出急性百草枯中毒的潛在生物標志物，尋找這些潛在生物標記物的生物學意義，并探討百草枯中毒與這些潛在生物標志物的聯(lián)系，為研究百草枯中毒的早期病情變化及發(fā)病機制提供新的思路。
　　方法：⑴將適應性喂養(yǎng)一周，斷食24小時的24只SD大鼠，按隨機

2、數(shù)字表法分為染毒組及對照組，每組12只。染毒組大鼠予以100mg/Kg的20％百草枯溶液一次性灌胃，對照組予以等量生理鹽水灌胃，于灌胃后2、24、48小時連續(xù)觀察大鼠一般情況及生命體征;按規(guī)定時間點收集大鼠腹主動脈血樣后將大鼠處死。⑵由于百草枯性質(zhì)比較穩(wěn)定、沸點高、不宜揮發(fā)，而GC-MS所能檢測的成分必須具有揮發(fā)性，所以加用一種合適的肟化-硅烷化來行衍生化預處理，使百草枯中毒大鼠血漿中的代謝物能被GC-MS提取和分析。通過對監(jiān)測離子行專

3、屬性掃描以及混合標準品樣本中各標準品相對含量的RSD值完成了方法學上的考察。結(jié)合NIST05標準質(zhì)譜庫和標準品完成內(nèi)源性代謝物的定性分析，采用和相同色譜圖中的內(nèi)標物相比較的歸一化峰面積方法完成半定量分析。⑶血漿樣品經(jīng)肟化-硅烷化預處理后，經(jīng)氣相色譜標準EI電子源分離后，進行質(zhì)譜全掃描分析，采集樣品中所有可檢測到的血漿化合物數(shù)據(jù)。通過主成分分析法(PCA)、偏最小二乘判別方法(PLS-DA)、隨機森林(RF)對血漿代謝物行代謝輪廓分析，并

4、進一步使用RF分析法篩選出與百草枯中毒有關(guān)的潛在生物標志物。
　　結(jié)果：①12只按隨機數(shù)字表選出的染毒組大鼠在灌胃后均未出現(xiàn)口鼻部百草枯溶液溢出或嗆咳，提示灌胃染毒成功。染毒組大鼠灌胃中毒后2小時逐漸表現(xiàn)出少動、腹部抽動、呼吸急促等中毒癥狀，24h時癥狀逐漸加重，精神變差，神情呆滯，至48h時大鼠除反應、進食進一步變差，還出現(xiàn)呼吸費力、肺部明顯的濕噦音、鼻部泡沫樣液體溢出等癥狀;對照組大鼠則生命體征平穩(wěn)，無不適癥狀。②選擇了大鼠血

5、漿代謝物檢測中必然會添加的內(nèi)標戊五醇碎片離子峰73(m/z)作為監(jiān)測離子以行專屬性掃描，提高檢測代謝物的準確性和靈敏性。13種混合標準品中各標準品的相對含量RSD值均小于20％，且得到了很好的分離，出峰時間及面積穩(wěn)定，說明本實驗方法可靠，儀器運行穩(wěn)定，實驗結(jié)果可用于后續(xù)的分析。③結(jié)合標準品、NIST05質(zhì)譜庫對大鼠百草枯中毒血清內(nèi)源性代謝物進行定性，共定性出27種代謝物，其中的13種用對照品進行定性，包括匹配度小于80％的血漿代謝物。另

6、外14個在NIST105質(zhì)譜庫中檢索。這27種代謝物中包括氨基酸、有機酸、糖類、脂肪酸以及膽固醇。④結(jié)合PCA及PLS-DA模型圖判別及RF的多維尺度變換圖，得出中毒組不同時間段大鼠血漿代謝分布較分散，而對照組分布比較密集，說明兩組體內(nèi)產(chǎn)生的代謝模式不同;而且染毒組大鼠灌胃2h起代謝軌跡較對照組偏移明顯，至48 h時其軌跡又與24小時組產(chǎn)生了進一步差距，表明大鼠在中毒早期血漿代謝產(chǎn)物已發(fā)生明顯差異且可被代謝組學檢測并形象體現(xiàn)出。⑤采用隨

7、機森林從27種定性出的代謝物中篩選出5種權(quán)重較大的潛在生物標志物，分別為絲氨酸、棕櫚酸、硬脂酸、天冬酰胺、花生四烯酸，主要干擾大鼠體內(nèi)的能量代謝及脂質(zhì)代謝。
　　結(jié)論：⑴百草枯在肟化-硅烷化以衍生處理后可用于GC-MS代謝組學研究，能夠得出穩(wěn)定的代謝圖譜，克服數(shù)據(jù)在采集時本身存在的一定缺陷。⑵通過代謝組學方法，篩選出5種與百草枯中毒有關(guān)的潛在生物標志物，通過觀察大鼠中毒后的不同時間毒性表現(xiàn)變化及對應時段代謝圖譜的變化，可在一定程度