基于GC-MS和LC-MS技術(shù)的肝病代謝組學(xué)研究.pdf

1、研究背景： 肝臟疾病種類繁多，我國(guó)以乙肝病毒所致的急慢性肝炎、肝硬化和肝癌最為多見(jiàn)，占肝病的80％以上。同時(shí)，隨著各類藥物(包括中醫(yī)中藥)使用的普及，藥物相關(guān)性肝病也逐年增多，占了所有肝病的2％～5％，占爆發(fā)性肝衰竭的15％～30％。肝臟作為機(jī)體代謝的重要器官，一旦受損，將影響全身各個(gè)器官的功能。其中，肝衰竭是嚴(yán)重肝損傷的極端表現(xiàn)，可表現(xiàn)為肝性腦病、肝腎綜合征、凝血功能異常等。已有研究表明，肝臟疾病發(fā)生后，不但引起肝臟功能的損傷

2、，還將引起全身代謝的紊亂。最常見(jiàn)的有芳香/支鏈氨基酸代謝紊亂、電解質(zhì)失平衡等。目前臨床上對(duì)電解質(zhì)的檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)相對(duì)完善，但對(duì)代謝產(chǎn)物的檢測(cè)尚缺少一種全面檢測(cè)的技術(shù)手段。 組學(xué)概念的提出為研究者提供了一個(gè)整體研究疾病的新思路，基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)等已經(jīng)不為大家所陌生，作為系統(tǒng)生物學(xué)最下游的代謝組學(xué)，是一門新的科學(xué)，主要研究生物體對(duì)病理生理刺激或基因修飾所產(chǎn)生代謝物的質(zhì)和量的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。這種整體的研究模式可全面了解代謝物質(zhì)

3、在疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的變化規(guī)律，對(duì)發(fā)病機(jī)制研究以及疾病的診斷、治療和療效評(píng)估具有重要意義。因此，我們采用該理論，結(jié)合現(xiàn)代生物質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)D-半乳糖胺誘導(dǎo)的藥物性肝衰竭動(dòng)物和乙肝所致的慢性肝炎、肝硬化和肝癌患者進(jìn)行代謝組學(xué)研究。 方法： 1、建立氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC/MS)為基礎(chǔ)的肝病血清代謝組學(xué)平臺(tái)，并應(yīng)用該技術(shù)對(duì)D-半乳糖胺誘導(dǎo)的急性肝衰竭動(dòng)物模型血清進(jìn)行代謝組學(xué)研究，監(jiān)測(cè)藥物性肝衰竭發(fā)生前后以及生物人工肝治

4、療前后代謝譜的變化規(guī)律，結(jié)合多元數(shù)據(jù)分析方法，評(píng)估代謝譜對(duì)肝衰竭動(dòng)物模型疾病診斷和預(yù)后判斷的有效性。 2、應(yīng)用GC/MS建立正常人代謝譜，并對(duì)乙肝病毒所致重型肝炎和肝癌患者血清進(jìn)行代謝組學(xué)研究，對(duì)照正常人的代謝譜，應(yīng)用多元數(shù)據(jù)分析方法診斷肝衰竭和肝癌，評(píng)估血清代謝組學(xué)對(duì)肝病的診斷效果。 3、建立超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC/MS)為基礎(chǔ)的代謝組學(xué)技術(shù)平臺(tái)，對(duì)D-半乳糖胺誘導(dǎo)的肝衰竭動(dòng)物模型進(jìn)行代謝譜檢測(cè)，結(jié)合多元數(shù)

5、據(jù)分析，評(píng)估造模以及人工肝治療對(duì)代謝譜的影響。 4、建立液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)乙肝病引起的肝病尿液代謝組學(xué)的方法，并對(duì)慢性活動(dòng)性乙肝、肝硬化、肝癌以及其他部位的炎癥和腫瘤患者的尿液進(jìn)行代謝譜研究。 5、探索常用統(tǒng)計(jì)方法以及多元統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析結(jié)果的影響，并驗(yàn)證其在疾病診斷中的應(yīng)用效果。 結(jié)果： 1、建立了GC/MS檢測(cè)肝病血清代謝譜的方法，在肝衰竭動(dòng)物血清中檢測(cè)到25種內(nèi)源性代謝物。應(yīng)用主成

6、分分析(PCA)、典型判別分析(CDA)對(duì)25種代謝物進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)肝衰竭動(dòng)物隨著病情進(jìn)展，代謝譜有一定的變化規(guī)律，生物人工肝治療可阻斷病情進(jìn)展，恢復(fù)動(dòng)物的代謝特征。 2、初步建立了GC/MS技術(shù)為基礎(chǔ)的正常人血清代謝譜；對(duì)乙肝病毒所致重型肝炎患者血清代謝譜進(jìn)行對(duì)照分析，并經(jīng)NIST數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定，獲得25個(gè)內(nèi)源性代謝物。經(jīng)t檢驗(yàn)，肝衰竭患者血清中有15個(gè)代謝物與正常人存在顯著性差異，苯丙氨酸、谷氨酸鹽等氨基酸在患者組中顯著

7、升高，果糖、葡萄糖等糖類顯著減少，部分脂類也發(fā)生顯著變化；通過(guò)正常與肝癌患者的比較，發(fā)現(xiàn)11個(gè)顯著改變的代謝物。將代謝組數(shù)據(jù)導(dǎo)入MATLAB、SIMCA-P軟件進(jìn)行主成分分析(PCA)、偏最小二乘法(PLS)等分析，代謝組數(shù)據(jù)可將正常人與肝衰竭和(或)肝癌患者分別聚類區(qū)分；應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行典型判別分析，以終末期肝病模型(MELD)作為疾病嚴(yán)重程度標(biāo)準(zhǔn)，代謝組數(shù)據(jù)可對(duì)重型肝炎的病情嚴(yán)重程度進(jìn)行分類。 3、建立了UPLC/MS為

8、基礎(chǔ)的肝病血清代謝組學(xué)研究平臺(tái)，并應(yīng)用于肝衰竭動(dòng)物模型。結(jié)合多元數(shù)據(jù)分析，LC/MS所檢測(cè)的代謝物與GC/MS截然不同，但分組聚類結(jié)果類似，不但能分析造模對(duì)代謝譜的影響，還可評(píng)估生物人工肝治療肝衰竭的作用。 4、建立了UPLC/MS檢測(cè)肝病尿液代謝組學(xué)的方法，對(duì)正常人、慢乙肝、肝硬化、肝癌以及其他器官炎癥和腫瘤的患者進(jìn)行代謝組分析，正常人與疾病組的代謝譜有顯著不同，應(yīng)用PCA、CDA、PLS等判別分析方法，可分別對(duì)正常人與慢乙肝

9、、肝硬化、肝癌患者進(jìn)行診斷。但三組患者不能完全分別聚類，肝硬化組患者分散于慢乙肝和肝癌患者聚類區(qū)域中。 5、對(duì)不同的統(tǒng)計(jì)軟件和數(shù)據(jù)處理方法進(jìn)行考察，MATLAB、SIMCA-P、SPSS等軟件的多元軟件可進(jìn)行代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的處理。 結(jié)論： GC/MS和LC/MS作為代謝組學(xué)研究的常用工具，對(duì)代謝譜的檢測(cè)具有互補(bǔ)作用。通過(guò)對(duì)急性肝衰竭動(dòng)物模型、重型肝炎、慢乙肝、肝硬化和肝癌的代謝組學(xué)研究，代謝組學(xué)數(shù)據(jù)具有很好的疾病診