大鼠丘腦前核參與學習記憶的分子生物學研究.pdf

1、目的:學習記憶是人類和動物生存不可缺少的重要功能。學習(learning)是獲得新信息和新知識的神經(jīng)過程,而記憶(memory)則是對所獲取信息的編碼、鞏固、保存和讀出的神經(jīng)過程。大腦具有多重記憶系統(tǒng),如記憶可分為陳述性記憶(declarative memory)和非陳述性記憶(non-declarative memory)等,不同類型的記憶在不同的腦區(qū)中貯存,海馬、丘腦、杏仁核、前額葉皮層及基底神經(jīng)節(jié)等都與學習記憶有關(guān)。近年來研究發(fā)現(xiàn)

2、丘腦前核在空間學習記憶中發(fā)揮重要作用。
　　 1973年Bliss和lomo首次在兔海馬觀察到突觸傳遞的長時程增強(Long term potentiation LTP)現(xiàn)象,長時程增強很可能是學習與記憶的神經(jīng)生理基礎(chǔ),而長時程增強現(xiàn)象的發(fā)生及維持過程與突觸前膜釋放谷氨酸的增加有關(guān)。本實驗室前期通過膠體金免疫電鏡等技術(shù)發(fā)現(xiàn)丘腦前核與邊緣皮質(zhì)學習記憶環(huán)路間存在的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)是谷氨酸,但丘腦前核內(nèi)是否存在NMDA受體研究較少。

3、r>　　 越來越多的研究證實,MAPK/ERK信號通路與腦內(nèi)長時程增強的形成以及學習記憶功能有重要的聯(lián)系。如經(jīng)水迷宮訓練后的大鼠,海馬CA1/CA1區(qū)ERK被激活,使用PD098059抑制MAPK/ERK級聯(lián)反應(yīng)則p-ERK蛋白含量降低,并且長期空間記憶的形成受損。丘腦前核在學習記憶過程中,ERK通路是否參與胞內(nèi)信號的轉(zhuǎn)導目前仍不清楚。
　　 即早基因(Immediate early genes IEGs)被認為是核內(nèi)的第三信

4、使,如大鼠海馬內(nèi)注射c-Fos的反義寡核苷酸后發(fā)現(xiàn)大鼠的長時記憶鞏固過程障礙。丘腦前核在空間學習記憶即早基因是否參與仍不清楚。
　　 突觸可塑性包括兩個方面,長時程增強(Long-term potentiation LTP)和長時程抑制(Long-term depression LTD),LTP和LTD對一個完整的學習記憶神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)均不可缺少,LTD在學習記憶中發(fā)揮著不斷糾正錯誤的作用。γ-氨基丁酸(γ-Amino butyric

5、 acid,GABA)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),GABA與LTD有關(guān)。目前丘腦前核內(nèi)GABA及其受體的表達仍不明確。
　　 本實驗?zāi)康氖窃谇捌诎l(fā)現(xiàn)丘腦前核內(nèi)存在谷氨酸神經(jīng)遞質(zhì)基礎(chǔ)上,探討丘腦前核內(nèi)NMDA受體表達,Morris水迷宮訓練后ERK1/2的變化以及c-Fos和c-Jun的表達。并探討抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABAA受體在丘腦前核的表達。
　　 方法：
　　 1.通過原位雜交觀察大鼠丘腦前核內(nèi)NR1

6、,NR2A及NR2BmRNA的表達及分布特點。
　　 2.成年雄性SD大鼠31只,分為3組:PD組:側(cè)腦室內(nèi)注射5ul PD098059溶液(PD0980593ug/只);PD對照組:側(cè)腦室內(nèi)注射5ul DMSO溶劑;正常組:未進行側(cè)腦室注射。在Morris水迷宮中,定位航行訓練后,行側(cè)腦室內(nèi)注射,24小時后空間探索實驗。免疫組化檢測p-ERK的變化。
　　 3.成年雄性SD大鼠分為3組,正常組:未經(jīng)Morris水迷宮訓

7、練;訓練組:通過Morris水迷宮訓練:假訓練組:撤掉平臺,每天游泳次數(shù)和游泳時間與訓練組相同。訓練后一半免疫組化檢測c-Fos和c-Jun的表達。另一部分行Western-Blot檢測c-Fos和c-Jun蛋白的表達。
　　 4.原位雜交觀察丘腦前核內(nèi)GABAAR-alpha1和GABAAR-beta2受體mRNA的表達。
　　 結(jié)果：
　　 1.NR2A,NR2B及NR1mRNA在丘腦前核都有表達,陽性神經(jīng)元

8、分布較密集,細胞形態(tài)較一致,整體分布尚均勻。NR2AmRNA及NR2BmRNA在丘腦前背側(cè)核和腹側(cè)核的分布前者稍顯密集,胞體略大。同時在海馬CA1,CA3及DG和扣帶后回也觀察到NR2A,NR2B及NR1 mRNA的表達?？瞻讓φ涨衅瑸殛幮?。
　　 2.在空間探索實驗中PD組尋找平臺次數(shù)與對照組及正常對照組相比明顯減少(P＜0.01)。PD組在靶象限停留時間與對照組及正常組相比明顯減少(P＜0.01)。正常組在靶象限停留時間和穿

9、越平臺次數(shù)與對照組相比沒有顯著差異,p＞0.05。
　　 p-ERK陽性表達神經(jīng)元呈棕黃色,為圓形或橢圓形,PD對照組與PD組與正常對照組比較,在丘腦前核p-ERK組表達明顯增強,光密度分析有顯著性差異(P＜0.01),PD組與正常對照組比較,在丘腦前核p-ERK無顯著差別。在PD對照組,丘腦前背側(cè)核(AD)的p-ERK免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物與丘腦前腹側(cè)核(AV)相比,表達顯著增強,光密度分析有顯著性差異(P＜0.05)?？瞻讓φ涨衅?/p>

10、為陰性,未見p-ERK表達陽性神經(jīng)元。
　　 3.c-Fos免疫組化陽性表達位于細胞核內(nèi),呈褐色的圓形或橢圓形。訓練組c-Fos陽性細胞在AD和AV均有表達,但AD與AV相比表達顯著增強,經(jīng)圖像平均光密度有顯著差異(P＜0.05)。訓練組丘腦前核c-Fos陽性細胞表達與正常對照組和假訓練組比較明顯增強,經(jīng)圖像平均光密度分析明顯增強(P＜0.05)。C-Jun免疫組化陽性表達位于細胞核內(nèi),呈褐色的圓形或橢圓形。訓練組c-Jun陽性

11、細胞在AD和AV均有表達,AD與AV相比染色略強,細胞稍顯密集,形態(tài)略大。正常對照組和假訓練組AD和AV的c-Jun陽性細胞都有弱的表達;但訓練組與正常對照組和假訓練組比較染色明顯增強,經(jīng)圖像分析平均光密度明顯增強(P＜0.05)。
　　 4.原位雜交:GABAAR-alpha1和GABAAR-beta2 mRNA原位雜交陽性反應(yīng)產(chǎn)物為棕黃色,主要分布在神經(jīng)元胞漿中。在AD和AV,陽性神經(jīng)元分布較密集,細胞形態(tài)較一致,在AD和A

12、V的分布前者稍顯密集。同時大腦其他學習記憶腦區(qū)如海馬CA1,CA3及DG和扣帶后回也觀察到GABAAR-alpha1和GABAAR-beta2mRNA的表達。
　　 結(jié)論：
　　 1.大鼠丘腦前核內(nèi)存在NR1、NR2A、NR2BmRNA的表達。提示丘腦前核在空間學習記憶信號轉(zhuǎn)導中細胞膜受體可能以NR1-NR2A,NR1-NR2B或NR1-NR2A-NR2B形式存在。
　　 2.大鼠通過Morris水迷宮訓練及應(yīng)用

13、PD098059后,大鼠空間參考記憶受損,p-ERK表達減弱,提示丘腦前核空間參考記憶細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導可能與MAPK途經(jīng)有關(guān)。在PD對照組,Morris水迷宮訓練后p-ERK在丘腦前背側(cè)核表達較丘腦前腹側(cè)核表達顯著增強(P＜0.001)。
　　 3.Morris水迷宮訓練后大鼠丘腦前核內(nèi)c-Fos和c-Jun蛋白表達顯著增加,提示核內(nèi)第三信使可能以Fos-Jun異源二聚體的形式,作用于靶基因AP1結(jié)合位點,啟動靶基因進一步轉(zhuǎn)錄。水