木霉菌REMI突變株耐受Cd機理及其對油菜富集Cd影響.pdf

1、多年來農田土壤重金屬污染是我國農產品安全生產的主要威脅，因此研究生物修復農業(yè)土壤關鍵技術具有重要意義。木霉菌是廣泛分布于植物根圍的有益微生物，除具有防治土傳植物病害的作用外，還發(fā)現(xiàn)可與植物形成共生體(symbiont)聯(lián)合修復農化物質對環(huán)境的污染，具有修復土壤重金屬污染的潛在價值。因此揭示木霉菌耐受重金屬和與修復性植物互作的機理是構建木霉菌-植物聯(lián)合修復農業(yè)土壤環(huán)境的技術基礎。
　　 本研究是通過限制性內切酶介導整合(Restr

2、iction enzyme mediated integration,REMI)技術構建并篩選獲得耐受Cd的木霉菌突變株，研究突變株耐受Cd及其對甘藍型油菜富集Cd的影響，主要結果如下：
　　 以康氏木霉(Trichoderma koningii) T30為出發(fā)菌，利用REMI技術檢構建了200株突變株，篩選獲得10株耐受Cd突變株，與野生株(T30)相比，突變株平均耐受Cd的IC50值增加1.5～2倍。去Cd率達到23～39％

3、，提高3～4倍。其中，突變株P6是最理想的突變株。REMI誘變技術提高了木霉菌對Cd引起的氧化脅迫效應的耐性水平。在Cd脅迫下，P6的MDA峰值小于T30，O2-峰值低且出現(xiàn)時間遲于野生株。P6的CAT被Cd脅迫誘導，活性迅速增加，4h時達峰值，增加31%。而T30僅有微小的增加。P6的SOD在4h峰值時增加45%，而T30在8h才出現(xiàn)峰值。P6中的GSH受Cd誘導最高增加1.6倍，T30最高增加2.3倍。
　　 電鏡觀察表明：

4、Cd主要在P6的細胞壁和液泡內富集，REMI突變可提高木霉菌細胞膜系統(tǒng)抗Cd損害性。P6吸附Cd后FTIR譜圖發(fā)生顯著變化，胞壁羥基、羧基和蛋白殘基是結合Cd的主要基團。P6菌絲體在液體中吸附Cd的過程符合準二級動力學方程(R2=0.9938)，1h基本達到吸附平衡，平衡吸附量為33.2mg/g。在18～47℃的范圍內溫度對吸附影響不顯著。吸附量隨pH增加而增加。能量抑制劑疊氮化鈉僅能部分抑制吸附。
　　 通過質粒搶救和RACE

5、技術從木霉菌中克隆了耐受Cd的相關基因，tkpah。該基因屬于磷脂酶A2家族GVⅡ亞群（GVⅢPLA2）。cDNA全長1，719bp，有一個65bp的內含子。同源重組敲除T30中的tkpah，Cd脅迫試驗顯示，敲除子菌絲和孢子對Cd耐性均有不同程度的提高，其中敲除子孢子對Cd和H2O2脅迫的耐受性增強最為明顯。說明該基因可能負調控木霉菌孢子對Cd的耐受性。
　　 P6菌絲蛋白質組學分析表明：Cd脅迫后的菌絲蛋白質發(fā)生明顯應答反應

6、，表現(xiàn)為總蛋白點數(shù)明顯較少，出現(xiàn)16個上調兩倍以上蛋白點和26個特異誘導產生的蛋白點。經(jīng)MALDI-TOF-TOF MS鑒定，發(fā)現(xiàn)多種耐Cd脅迫蛋白如熱激蛋白、磷酸甘油酸變位酶、泛素蛋白連接酶等。
　　 盆栽試驗表明：P6增強了甘藍型油菜(滬油17和滬油20)對土壤Cd脅迫的耐受，促進油菜對土壤Cd的吸附。與CK和野生株(T30)接種處理相比，在20mgkg-1Cd污染的土壤中，接種P6的滬油17地上部組織干重分別增加21%和2

7、0%，滬油20則分別增加44%和24%;在50mgkg-1Cd污染的土壤中，接種P6的滬油17地上部組織干重分別增加53%和31%，滬油20則分別增加16%和17%。P6還增加了油菜地上部組織Cd濃度。與CK和T30處理相比，在20mgkg-1Cd的土壤中，接種P6的滬油17地上部組織中的Cd濃度分別增加27%和13%，滬油20則分別增加8%和6%:在50mgkg-1Cd的土壤中，接種P6的滬油17地上部組織中的Cd濃度分別增加35%和