木霉菌生物修復(fù)氰化物污染土壤與水質(zhì)的REMI突變株構(gòu)建與作用機理.pdf

1、氰化物是冶金、化工，制藥，纖維制造等工業(yè)排放的主要污染物，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境安全造成較大危害。應(yīng)用物理和化學(xué)方法對氰化物污染治理成本高，并易造成二次污染，因此選擇對環(huán)境安全的生物修復(fù)技術(shù)已成為治理氰化物環(huán)境污染的關(guān)鍵技術(shù)之一。木霉作為傳統(tǒng)的生物修復(fù)微生物，已證明對氰化物污染具有一定的修復(fù)作用，但常需要借助與修復(fù)性植物的共生作用才能實現(xiàn)，而野生木霉菌單一使用對氰化物污染修復(fù)效率尚不理想，需要通過生物工程技術(shù)對其進行改良。限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)

2、的基因整合技術(shù)（REMI）是目前通過插入突變進行真菌分子改良的重要途徑。 本文通過REMI插入突變技術(shù),以Trichoderma koningii T30、Trichoderma atroviride T23和Trichoderma harzianum T21為出發(fā)菌，獲得了81個轉(zhuǎn)化子，并經(jīng)過繼代培養(yǎng)、PCR擴增和Southern blot，證明線性pV2質(zhì)粒DNA已成功插入木霉菌基因組，單拷貝率達到71.4％，形成了優(yōu)化的

3、木霉菌分子改良技術(shù)體系，為今后克隆生物修復(fù)相關(guān)基因奠定了重要基礎(chǔ)。分析了轉(zhuǎn)化子降解氰化物相關(guān)酶系（硫氰酸酶和氰水合酶）活性，其中16株轉(zhuǎn)化子（TkA2，TkA4，TkA8，TkA9，TkB5，TkB6，TkB8,，TkC9，TaE1，TaI1，TaJ9，TaK1，TaL8，TaQ5, TaR7，Th64）降解酶活性明顯高于出發(fā)菌株。初步比較研究了REMI轉(zhuǎn)化子硫氰酸酶的最佳反應(yīng)條件，其反應(yīng)最佳pH值為8-10之間，最佳反應(yīng)溫度在30℃-

4、40℃之間，與相應(yīng)的出發(fā)菌酶活條件基本相同。氰化物降解酶誘導(dǎo)性研究表明：轉(zhuǎn)化子TkA8產(chǎn)生的硫氰酸酶和氰水合酶為固有組成酶，不需要氰化物誘導(dǎo)便可表達。 為了篩選具有降解氰化物和防病作用的多功能微生態(tài)菌劑，拓展轉(zhuǎn)化子適用性，將16株具有降解氰化物活性的轉(zhuǎn)化子進行拮抗病原菌(黃瓜枯萎病，甜瓜枯萎病，立枯絲核菌，萵苣菌核病，灰霉病)活性測定，結(jié)果表明：7株轉(zhuǎn)化子表現(xiàn)出較高的拮抗活性，而且多數(shù)轉(zhuǎn)化子對黃瓜幼苗枯萎病具有明顯的防效，其中

5、轉(zhuǎn)化子TkA8的防治效果最好，達到了73.5％。同時研究發(fā)現(xiàn)TkA8處理黃瓜幼苗可誘導(dǎo)防御反應(yīng)相關(guān)酶系PAL，POD活性明顯增加，分別為對照的3.21和4.25倍。進一步研究發(fā)現(xiàn)，TkA8可降解污染土壤中的氰化物，明顯減輕氰化物對小麥生長的抑制作用，因此TkA8是一種具有防病和生物修復(fù)氰化物污染的較理想的多功能轉(zhuǎn)化子。 為了提高轉(zhuǎn)化子在修復(fù)氰化物污染中效率和穩(wěn)定性，本研究開展海藻酸鈉固定TkA8及降解水體中氰化物活性測定。研究

6、明確了TkA8固定化處理最佳參數(shù)：3 ％海藻酸鈉，3％ CaCl2，5g濕菌絲，加入100 mL海藻酸鈉，反應(yīng)初始pH為6.5，溫度為28℃。固定化處理的TkA8菌絲培養(yǎng)物降解游離氰化物和金屬氰化物的效率和穩(wěn)定性都高于游離菌絲培養(yǎng)物，固定化TkA8處理氰化物污染可以續(xù)使用5次以。因此，固定化REMI轉(zhuǎn)化子在修復(fù)水體污染中具有應(yīng)用價值。 為了尋找轉(zhuǎn)化子中與氰化物降解相關(guān)基因，本研究利用蛋白質(zhì)組技術(shù)對出發(fā)菌株T30及TkA8進行了