歐文氏菌類(lèi)胡蘿卜素合成相關(guān)基因遺傳轉(zhuǎn)化水稻的初步研究.pdf

1、水稻(Oryza sativa L)是世界上最重要的糧食作物之一，水稻的穩(wěn)定高產(chǎn)是我國(guó)糧食安全的重要保障。然而，水稻生長(zhǎng)期間經(jīng)常遭受自然界多種多樣的逆境脅迫傷害，由此而造成的活性氧增多會(huì)引發(fā)細(xì)胞氧化傷害，最終導(dǎo)致水稻大量減產(chǎn)，并嚴(yán)重影響水稻的品質(zhì)。提高水稻產(chǎn)量，改善水稻品質(zhì)是水稻育種方面重要的研究?jī)?nèi)容，人們通過(guò)植物基因工程將抗氧化的基因?qū)胨净蚪M，期望獲得高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的優(yōu)良品種。 類(lèi)胡蘿卜素(carotenoid)是植物和微生物

2、光合膜的組成部分，可保護(hù)光合系統(tǒng)免受強(qiáng)光氧化破壞。許多類(lèi)胡蘿卜素是維生素A的重要來(lái)源，又是強(qiáng)抗氧化劑。歐文氏菌(Erwinia uredovora)作為一種微生物，擁有比植物簡(jiǎn)單而且節(jié)能的類(lèi)胡蘿卜索合成途徑。而其中crtB，crtI，crtY是β-胡蘿卜素合成過(guò)程中幾個(gè)關(guān)鍵的酶。 本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)基因工程技術(shù)以pACCAR16△crtX質(zhì)粒為模板，PCR克隆得到歐文氏菌中類(lèi)胡蘿卜素合成途徑中三個(gè)關(guān)鍵基因crtB，crtI，crtY

3、；再用綠色組織特異性啟動(dòng)子Cab及其導(dǎo)肽分別與crtB，crtI，crtY連接構(gòu)建表達(dá)盒CBN(Cab-crtB-NOS)，CIN(Cab-crtI-NOS)以及CYN(Cab-crtY-NOS)，驅(qū)動(dòng)三者的表達(dá)。將表達(dá)盒導(dǎo)入雙元轉(zhuǎn)化載體pC1301中構(gòu)建三個(gè)綠色組織特異性轉(zhuǎn)基因載體；然后一方面通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法將pC1301-Cab-crtB-NOS、pC1301-Cab-crtI-NOS和pC1301-Cab-crtY-NO

4、S分別單獨(dú)轉(zhuǎn)化水稻品種粳稻中花11及秈稻9311，最終獲得含crtB、crtI、crtY基因的轉(zhuǎn)基因水稻各40株；另一方面通過(guò)基因槍介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法將三個(gè)重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化水稻品種粳稻中花11，獲得轉(zhuǎn)基因植株20株。之后對(duì)轉(zhuǎn)基因愈傷組織、根及種子的GUS報(bào)告基因活性進(jìn)行鑒定，鑒定陽(yáng)性率達(dá)80％，初步證明轉(zhuǎn)基因成功；成苗后對(duì)轉(zhuǎn)基因T0代植株葉片提取DNA，進(jìn)行PCR鑒定進(jìn)一步證明crtB、crtI、crtY基因轉(zhuǎn)化水稻獲得成功。 除此

5、之外，克隆crtB，crtI，crtY基因插入原核表達(dá)載體pet32a，在大腸桿菌BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行表達(dá)，實(shí)驗(yàn)表明蛋白主要以包涵體形式表達(dá)：經(jīng)SDS-PAGE分離獲得抗原并免疫新西蘭白兔制備了crtB，crtI，crtY抗體；經(jīng)Western blot檢測(cè)，抗體血清以梯度稀釋至107倍時(shí)依然可以與抗原雜交獲得清晰、明顯的條帶，證明獲得的抗體血清，特異性好，效價(jià)高達(dá)到1:10000000，為進(jìn)一步鑒定轉(zhuǎn)基因水稻中crtB，crtI