lux標記的汞特異生物傳感器構建及其在污染土壤檢測中的應用.pdf

1、本研究目的是構建細菌熒光素酶基因(lux)標記的汞特異生物傳感器并對其在汞污染土壤中檢測應用的可行性進行探討。本研究內容主要包括：兩株lux標記工程菌的構建以及發(fā)光性能的比較分析、改造Pseudomonas putida X4菌株的內生質粒構建汞響應的發(fā)光標記菌株以及組成型發(fā)光的對照菌株、X4發(fā)光標記菌株在汞污染土壤檢測中的應用等三個方面。結果如下：
　　 1．分別以P. putida X4，Enterobacter aerog

2、enes NTG-01為宿主菌，構建含有mer R-lux CDABE標記的重組質粒，并通過氯化鈣法將質粒導入到已消除質粒的X4和NTG-01宿主菌株中，構建兩株汞特異生物傳感器，并對其發(fā)光性能進行比較研究。結果表明：NTG-01發(fā)光標記菌株的最佳誘導時期是對數生長末期，而X4發(fā)光標記菌株的最佳誘導時期是對數生長中期；兩發(fā)光標記菌株的最短誘導時間是30 min，隨著誘導時間的延長發(fā)光強度增大，X4標記菌株在誘導4h時達到最大光強，而NT

3、G-01在Sh達到最大光強；在28℃、pH7、起始細胞數量為106CFU/mL時，兩傳感器對汞的最低檢測限為100 pmol/L;其他重金屬離子(Cd2+，Zn2+，C02+，Cu2+，Pb2+)在nanomolar水平不會干擾實驗的測定。
　　 2．以luxABCDE為報告基因，改造X4菌株的內生質粒pX4，形成lux標記的重組質粒pUC-luxABCDE-merR-Kan-X4以及pUC-luxABCDE-Kan-X4，并通

4、過電轉化將重組質粒導入到已經消除質粒的宿主菌X4中，構建lux標記的特異性汞響應發(fā)光菌株以及組成型發(fā)光的對照菌株。通過比較對照菌株在不同汞濃度下發(fā)光強度的變化，研究了汞對微生物細胞的毒害以及誘導作用。結果表明：低于1μmol/L汞對微生物細胞基本沒有毒害作用，主要是誘導作用；1～10μmol/L汞對細胞既有毒害作用又有誘導作用，發(fā)光值急劇下降；高于20μmol/L汞對細胞主要是毒害作用；100μmol/L時，發(fā)光值降到零，很顯然是由于汞

5、的毒性效應所致。
　　 3．以X4(pUC-luxABCDE-merR-Kan-X4)為研究對象，對該工程菌在農田土壤的定殖存活能力以及對汞污染土壤檢測的可行性進行探討。結果表明：該工程菌株在滅菌土壤和天然土壤中的存活趨勢基本相同，在30 d后仍可保持在104 CFU/g土壤；四個不同汞污染程度的土壤，利用生物傳感器檢測的土壤水抽提液汞的濃度均稍低于化學檢測方法。研究結果顯示：生物傳感器方法與化學方法有效結合可以對污染土壤生物可