氮代謝調(diào)控因子Dal80p對(duì)黃酒釀造中氨基甲酸乙酯形成的影響.pdf

1、黃酒是我國(guó)傳統(tǒng)釀造食品，因其獨(dú)特的風(fēng)味和豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)廣受消費(fèi)者喜愛(ài)。但研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵酒精飲品中存在氨基甲酸乙酯，并且對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物造成多位點(diǎn)致癌。2007年國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)將氨基甲酸乙酯提升為對(duì)人類具有潛在致癌性的物質(zhì)（2A級(jí)別）。因?yàn)榘l(fā)酵飲品中氨基甲酸乙酯會(huì)對(duì)飲酒人群的健康造成威脅，所以對(duì)氨基甲酸乙酯的安全調(diào)控是目前黃酒釀造中面臨的主要科學(xué)難題。黃酒中氨基甲酸乙酯形成的主要前體物為尿素，并且尿素主要來(lái)源于發(fā)酵原料和發(fā)酵后期釀酒

2、酵母對(duì)精氨酸的降解，而精氨酸的代謝主要受氮代謝抑制的調(diào)控。本研究將基于氮代謝抑制調(diào)控機(jī)制來(lái)探究黃酒中氨基甲酸乙酯的調(diào)控途徑。主要研究結(jié)果和結(jié)論如下:
　　(1)釀造后期添加硫酸銨作為補(bǔ)充氮源，并且對(duì)釀造過(guò)程中精氨酸濃度、尿素濃度、氨基甲酸乙酯濃度，和釀造產(chǎn)品中酒精度、風(fēng)味物質(zhì)組成、氨基酸組成的測(cè)定結(jié)果表明:發(fā)酵20天時(shí)添加5g/L硫酸銨使發(fā)酵液中精氨酸濃度明顯比不添加硫酸銨的對(duì)照組濃度高，尿素與氨基甲酸乙酯的濃度分別比對(duì)照組降低2

3、4％和16％，發(fā)酵產(chǎn)品的酒精度、風(fēng)味物質(zhì)組成以及氨基酸組成與對(duì)照組差異不大。
　　采用釀酒酵母BY4741和SC替代酒藥（對(duì)照組）進(jìn)行釀造，并且對(duì)釀造過(guò)程中精氨酸濃度、尿素濃度、氨基甲酸乙酯濃度，和釀造產(chǎn)品中酒精度、風(fēng)味物質(zhì)組成、氨基酸組成的測(cè)定結(jié)果表明:釀造過(guò)程中精氨酸濃度始終低于對(duì)照組，而尿素和氨基甲酸乙酯的濃度與對(duì)照組中差異不大，發(fā)酵產(chǎn)品的酒精度、風(fēng)味物質(zhì)組成以及氨基酸組成差異不大。因此，在后續(xù)的研究中可以應(yīng)用釀酒酵母BY4

4、741和SC替代酒藥作為研究對(duì)象，來(lái)探究氨基甲酸乙酯形成的分子學(xué)基礎(chǔ)。
　　(2)應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析方法對(duì)三種不同培養(yǎng)條件下的釀酒酵母氮代謝相關(guān)基因進(jìn)行分析，高氮水平組中基因表達(dá)水平作為參照（低氮水平組:YNB培養(yǎng)基中添加2mM硫酸銨和20mM精氨酸;高氮水平組:YNB培養(yǎng)基中添加40mM硫酸銨和20mM精氨酸;添加雷帕霉素組，YNB培養(yǎng)基中添加40mM硫酸銨、20mM精氨酸和20nM雷帕霉素）。結(jié)果表明:1.低氮處理（低氮組vs高

5、氮組）和添加雷帕霉素處理（雷帕霉素組vs高氮組）條件下，差異基因富集的代謝通路都主要包括碳水化合物代謝和氨基酸代謝。2.在低氮條件下（低氮組vs高氮組），大部分受氮代謝抑制調(diào)控的基因轉(zhuǎn)錄水平均有提高，這與報(bào)道中脯氨酸作為唯一氨基酸氮源時(shí)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平一致。3.低氮處理（低氮組vs高氮組）和添加雷帕霉素處理（雷帕霉素組vs高氮組）條件下差異表達(dá)基因僅有少量基因轉(zhuǎn)錄水平變化一致（69個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，9個(gè)基因下調(diào)表達(dá)），說(shuō)明TOR信號(hào)途徑

6、和氮代謝抑制之間是兩條平行的代謝通路。4.在低氮條件下，氨代謝抑制調(diào)控機(jī)制的四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子中僅有Dal80p表達(dá)量顯著提高，基于已有報(bào)道中Dal80p對(duì)DUR1，2的轉(zhuǎn)錄抑制作用，本研究將Dal80p作為氨基甲酸乙酯的潛在調(diào)控因子。
　　(3)對(duì)Dal80p與Gln3p鋅指結(jié)構(gòu)域的三級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)結(jié)果表明，Dal80p與Gln3p的核酸結(jié)合域高度同源。Dal80p分別與CAR1和DUR1，2的凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)表明Dal80p對(duì)精

7、氨酸降解酶編碼基因CAR1結(jié)合作用較弱，而對(duì)于尿素降解酶編碼基因DUR1，2結(jié)合作用較強(qiáng)，這說(shuō)明Dal80p對(duì)尿素降解酶具有轉(zhuǎn)錄抑制作用。
　　(4)以DAL80敲除菌為研究對(duì)象，開(kāi)展在低氮模擬發(fā)酵體系中的氮代謝水平研究，對(duì)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、精氨酸濃度、尿素濃度、精氨酸酶活性、脲酶活性、熒光定量PCR測(cè)定結(jié)果表明:1.BY4741和DAL80敲除菌分別在低氮和高氮條件下，酵母細(xì)胞生長(zhǎng)曲線差異性不大，這說(shuō)明敲除DAL80基因不影響酵

8、母的生長(zhǎng)性能。2.DAL80敲除菌在低氮條件下，精氨酸酶活略高，但發(fā)酵液中精氨酸含量與高氮源條件下差異不大，脲酶活性保持較高水平不受發(fā)酵液中氮源濃度影響，發(fā)酵液中尿素濃度在低氮和高氮下均較低。3.RT-PCR結(jié)果表明敲除DAL80基因能夠提高GAP1、DUR1，2、DUR3的轉(zhuǎn)錄水平，而對(duì)CAR1的轉(zhuǎn)錄水平影響不大，該研究結(jié)果與凝膠遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。綜上所述，敲除DAL80不影響酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)性能，而且能夠解除Dal80p對(duì)脲酶的抑制作

9、用。
　　應(yīng)用DAL80敲除菌部分替代或者完全替代傳統(tǒng)酒藥進(jìn)行釀造試驗(yàn)，對(duì)發(fā)酵液中尿素濃度、精氨酸濃度、氨基甲酸乙酯濃度，和釀造產(chǎn)品中酒精度、風(fēng)味物質(zhì)組成、氨基酸組成的測(cè)定結(jié)果表明:1.DAL80敲除菌部分替代或者完全替代酒藥釀造時(shí)，發(fā)酵液中精氨酸濃度與BY4741未敲除釀造組水平差異不明顯。2.尿素濃度和氨基甲酸乙酯濃度均比酒藥發(fā)酵組和BY4741未敲除釀造組略低，發(fā)酵30天后氨基甲酸乙酯分別降低19.6％和38.5％。3.釀造

10、產(chǎn)品中酒精度、風(fēng)味物質(zhì)組成、氨基酸組成與酒藥釀造組差異不明顯?；谠撗芯拷Y(jié)果，應(yīng)用DAL80敲除菌替代酒藥進(jìn)行釀造能有效抑制氨基甲酸乙酯的形成，同時(shí)不影響釀造產(chǎn)品的品質(zhì)。
　　本研究首先基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析篩選出Dal80p作為氨基甲酸乙酯產(chǎn)生的潛在抑制因子;然后通過(guò)蛋白質(zhì)與核酸結(jié)合實(shí)驗(yàn)、DAL80敲除菌的代謝基礎(chǔ)研究闡明 Dal80p對(duì)尿素代謝的調(diào)控機(jī)制，為DAL80敲除菌應(yīng)用于黃酒釀造提供理論基礎(chǔ);最后將DAL80敲除菌應(yīng)用于黃酒