海灘牽牛正丁醇部位單體配伍與配比優(yōu)化及協(xié)同作用研究.pdf

1、中藥復(fù)方配伍優(yōu)化或多藥物聯(lián)用研究是中藥工作者長期研究的一大難題，現(xiàn)有的研究模式仍不能有效解決多藥物聯(lián)用的配伍優(yōu)化問題。海灘牽牛(Ipomoea stolonifera，IS)是潮汕地區(qū)用于抗炎、抗風(fēng)濕的地道草藥，前期研究表明，IS正丁醇部位(n-butanol extract of IS，BE-IS)具有顯著的抗炎活性，并從該部位分離得到具有抗炎作用的多個(gè)成分。本課題通過研究BE-IS單體抗炎聯(lián)合作用的配伍與劑量配比優(yōu)化，探索多藥物聯(lián)用

2、的協(xié)同作用研究的思路和模式。
　　方法：
　　1、建立巴豆油所致小鼠耳腫脹模型，評(píng)價(jià)BE-IS單體，即東莨菪亭(Scopoletin，Sco)、傘形花內(nèi)酯(Umbelliferone，Umb)、秦皮乙素(Esculetin，Esc)、橙皮素(Hesperetin，Hes)及姜黃素(Curcumin，Cur)在體內(nèi)的抗炎作用。
　　2、建立脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞RAW26

3、4.7模型，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、蛋白免疫印跡法(western blot)分別檢測BE-IS單體對(duì)前列腺素(prostaglandin，PG) E2釋放和環(huán)氧酶(cyclooxygenase，COX)-2蛋白表達(dá)的影響，評(píng)價(jià)BE-IS單體在體外的抗炎作用，并初步探討其抗炎機(jī)制。
　　3、通過均勻設(shè)計(jì)法考察BE-IS單體在細(xì)胞模型上聯(lián)用的最優(yōu)配比和預(yù)期最佳藥效，選用均勻設(shè)計(jì)表U11(115)安排11組不同水平組合的實(shí)驗(yàn)，聯(lián)

4、用藥效以對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放PGE2的抑制作用表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用EXCEL規(guī)劃求解工具分析。
　　4、采用正交設(shè)計(jì)法進(jìn)行BE-IS單體在細(xì)胞模型上的配伍分析，篩選主成分，選用正交設(shè)計(jì)表L16(45)，安排16組不同水平組合的實(shí)驗(yàn)，聯(lián)用效應(yīng)以對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放PGE2的抑制作用表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過直觀分析法和方差分析法相結(jié)合進(jìn)行分析。
　　5、采用均勻設(shè)計(jì)法分析BE-IS主成分在細(xì)胞模型上聯(lián)用的

5、最優(yōu)配比和預(yù)期最佳藥效，選用均勻設(shè)計(jì)表U7(73)，安排7組不同水平組合的實(shí)驗(yàn)，聯(lián)用藥效以對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放PGE2的抑制作用表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用EXCEL規(guī)劃求解工具和曲面分析。
　　6、根據(jù)均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化結(jié)果，固定聯(lián)用比例，利用中效原理法分析在細(xì)胞模型上BE-IS主成分之間的相互作用，根據(jù)合并指數(shù)(combination index，CI)判定藥物之間存在協(xié)同或相加或拮抗作用。
　　7、通過測定BE-IS

6、主成分對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放一氧化氮(Nitric oxide，NO)、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)-α、白介素(Interleukin，IL)-1β和IL-6的影響，探討B(tài)E-IS主成分抗炎協(xié)同作用的機(jī)制。
　　8、采用均勻設(shè)計(jì)法分析BE-IS主成分在整體模型上聯(lián)用的最優(yōu)配比和預(yù)期最佳藥效，選用均勻設(shè)計(jì)表U7(73)，安排7組不同水平組合的實(shí)驗(yàn)，聯(lián)用藥效以對(duì)巴豆油所致小鼠耳腫脹

7、的抑制作用表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用EXCEL規(guī)劃求解工具和曲面分析。
　　9、通過驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，比較BE-IS主成分在最佳濃度或劑量時(shí)單用和聯(lián)用在細(xì)胞模型上對(duì)LPS誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子釋放的影響，及在整體模型上對(duì)巴豆油所致小鼠耳腫脹的影響。
　　結(jié)果：
　　1、在整體模型上，與對(duì)照組相比，BE-IS單體均能不同程度抑制巴豆油所致小鼠耳腫脹，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　2、在細(xì)胞模型上，BE-IS單體均能不

8、同程度抑制LPS誘導(dǎo)PGE2的釋放，呈濃度依賴關(guān)系，量效關(guān)系均符合Hill模型。Sco、Umb、Hes和Cur能抑制LPS誘導(dǎo)的COX-2蛋白表達(dá)。
　　3、通過EXCEL規(guī)劃求解分析得到BE-IS單體聯(lián)用的最佳配比濃度是：Sco5.9μM，Umb17.9μM，Esc12.4μM，Hes9.5μM，Cur4.1μM，預(yù)期最佳藥效為100.06％。
　　4、通過直觀分析法和方差分析法結(jié)合分析得到Esc、Cur和Hes是BE-I

9、S單體聯(lián)用發(fā)揮藥效的主成分。
　　5、通過EXCEL規(guī)劃求解和曲面分析得到BE-IS主成分在細(xì)胞模型上聯(lián)用的最佳配比濃度是：Esc11.6μM，Cur8.5μM，Hes12.5μM，預(yù)期最佳藥效為99.77%
　　6、中效原理法證明BE-IS主成分在最佳配比時(shí)聯(lián)用兩兩之間具有協(xié)同作用。
　　7、在LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞模型上，Cur顯著抑制NO(IC50=15.08μM)和IL-1β(IC50=33.69μM

10、)的釋放，Esc顯著抑制IL-6(IC50=28.29μM)的釋放。
　　8、通過EXCEL規(guī)劃求解和曲面分析得到BE-IS主成分在整體模型上聯(lián)用的最佳配比劑量是：Esc337mg/kg，Cur60mg/kg，Hes191mg/kg，預(yù)期最佳藥效為99.63%。
　　9、驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在細(xì)胞和整體模型上，BE-IS主成分在最佳濃度或劑量下聯(lián)用能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的PGE2、NO、TNF-α、IL-1β和IL-6釋放及巴