蕨麻正丁醇部位對(duì)EAHY926內(nèi)皮細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：研究蕨麻正丁醇部位對(duì)EAHY926內(nèi)皮細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用，并探討其可能機(jī)制。
　　 方法：①人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（EAHY926），用含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基在37℃、5％CO2、飽和濕度下培養(yǎng)，至EAHY926細(xì)胞生長(zhǎng)成單層后備用。②采用MTT、臺(tái)盼藍(lán)染色及LDH（乳酸脫氫酶）活性檢測(cè)，確定細(xì)胞的適宜缺氧時(shí)間，建立細(xì)胞缺氧損傷模型。③細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照組、缺氧損傷模型組、復(fù)方丹參陽(yáng)性藥物組、蕨麻正丁醇部位

2、3mg/ml、1.5mg/ml、0.75mg/ml干預(yù)組（缺氧同時(shí)加入蕨麻正丁醇部位）。MTT法檢測(cè)細(xì)胞代謝活力、臺(tái)盼藍(lán)染色觀察細(xì)胞存活率、比色法檢測(cè)細(xì)胞外LDH活性。④H.E染色觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。⑤檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）活性、脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量。⑥檢測(cè)細(xì)胞外一氧化氮合酶（NOS）活性、一氧化氮（NO）含量及內(nèi)皮素-1（ET-1）含量。⑦RT-PCR技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞HIF-1α、ET-1、eNOS、iN

3、OS mRNA表達(dá)，免疫細(xì)胞化學(xué)染色及Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞HIF-1α、eNOS蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.在倒置顯微鏡下觀察，正常組EAHY926細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，呈上皮樣貼壁生長(zhǎng)，折光性強(qiáng)，細(xì)胞呈多角形或長(zhǎng)梭形，鵝卵石樣鋪滿底層。
　　 2.蕨麻正丁醇部位對(duì)EAHY926細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用：（1）MTT：與對(duì)照組比較，缺氧損傷模型組細(xì)胞代謝活力下降（P<0.01）；與缺氧損傷模型組比較

4、，高、中、低劑量蕨麻正丁醇部位組細(xì)胞代謝活力均顯著提高（P<0.01）。（2）臺(tái)盼藍(lán)染色：高、中、低劑量蕨麻正丁醇部位藍(lán)染死細(xì)胞數(shù)量均減少，細(xì)胞存活率提高（低劑量組P<0.05，高、中劑量組P<0.01）。（3）H.E染色：缺氧損傷模型組細(xì)胞皺縮，核固縮、深染，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞間聯(lián)系減少。蕨麻正丁醇部位干預(yù)后，上述損傷均減輕。（4）生化指標(biāo)：與對(duì)照組比較，缺氧損傷模型組細(xì)胞外LDH活性顯著升高（P<0.01）；與缺氧損傷模型組比較，蕨

5、麻正丁醇部位各劑量組細(xì)胞LDH活性均顯著降低（P<0.01）。
　　 3.蕨麻正丁醇部位對(duì)EAHY926細(xì)胞缺氧損傷保護(hù)作用的機(jī)制研究：（1）生化檢測(cè)：與對(duì)照組比較，缺氧損傷模型組細(xì)胞內(nèi)SOD活力下降（P<0.01）；與缺氧損傷模型組比較，蕨麻正丁醇部位組可提高內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)SOD活力（P<0.05，高、低劑量組P<0.01）。但各組MDA含量無顯著差異（P>0.05）。與對(duì)照組比較，缺氧損傷模型組細(xì)胞NOS活性增加（P<0.01）

6、，NO含量減少（P<0.01），ET-1含量增加（P<0.01）；而蕨麻正丁醇部位各劑量組與缺氧損傷模型組比較細(xì)胞NO合成均增加（P<0.01），NOS活性（P<0.01）及ET-1含量均降低（P<0.01）。（2）免疫細(xì)胞化學(xué)染色：缺氧損傷模型組較對(duì)照組細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)水平增加（P<0.01），eNOS蛋白表達(dá)水平降低（P<0.01）；與缺氧損傷模型組比較，高、中劑量蕨麻正丁醇部位組、復(fù)方丹參組細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)水平均降

7、低（P<0.01）；蕨麻正丁醇部位各劑量組、復(fù)方丹參組細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá)水平均升高（P<0.01）。（3）RT-PCR：與對(duì)照組比較，缺氧損傷模型組HIF-1α mRNA、ET-1 mRNA、iNOS mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），eNOS mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）。與缺氧損傷模型組比較，蕨麻正丁醇部位各劑量組、復(fù)方丹參組細(xì)胞HIF-1α mRNA水平顯著降低（P<0.01）；高、中劑量蕨麻正丁醇部位組、復(fù)

8、方丹參組ET-1 mRNA表達(dá)水平降低（P<0.01）：高、中劑量蕨麻正丁醇部位組、復(fù)方丹參組eNOS mRNA表達(dá)水平增加（P<0.01）；高劑量蕨麻正丁醇部位組iNOSmRNA表達(dá)水平降低（P<0.01）。（4）Western Blot：缺氧損傷模型組較對(duì)照組細(xì)胞HIF-1α表達(dá)升高（P<0.01）、eNOS表達(dá)降低（P<0.01）。與缺氧模型組比較，蕨麻正丁醇部位各劑量組及復(fù)方丹參組細(xì)胞HIF-1α表達(dá)降低（高劑量組P<0.05，

9、中、低劑量組及復(fù)方丹參組P<0.01）；高、中劑量蕨麻正丁醇部位組及復(fù)方丹參組細(xì)胞eNOS表達(dá)均升高（P<0.01）。
　　 結(jié)論：蕨麻正丁醇部位能夠減輕缺氧對(duì)EAHY926細(xì)胞的損傷，減少LDH釋放，增強(qiáng)細(xì)胞代謝活力，提高細(xì)胞存活率，對(duì)：EAHY926細(xì)胞缺氧損傷具有保護(hù)作用。這種保護(hù)作用的機(jī)制可能為：在缺氧時(shí)提高細(xì)胞清除氧自由基的能力；增加eNOS mRNA表達(dá)，促進(jìn)NO產(chǎn)生；并經(jīng)HIF-1α途徑降低ET-1 mRNA和iN