利用原子力顯微鏡對(duì)雙鏈DNA堿基相互作用力的檢測(cè).pdf

1、為了探討細(xì)胞內(nèi)部的基因表達(dá)調(diào)控、信息傳導(dǎo)、物質(zhì)代謝和能量轉(zhuǎn)換過程在維系細(xì)胞的正常生物學(xué)行為中的作用，認(rèn)識(shí)這些過程的非正?；绾螌?dǎo)致細(xì)胞的非正常生物行為，人們不僅需要在分子水平上了解每個(gè)生化過程的內(nèi)涵，而且還需要對(duì)細(xì)胞的形貌特征、物理學(xué)性質(zhì)以及生理學(xué)信息進(jìn)行全面的解析和詮釋。利用微觀測(cè)與微操控技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞在不同的生理和病理狀態(tài)下的形貌特征和物理學(xué)特性，從中提取能夠反映細(xì)胞內(nèi)部生物反應(yīng)和細(xì)胞狀態(tài)的生物標(biāo)志物信息，揭示細(xì)胞物理學(xué)參數(shù)與細(xì)胞生物

2、學(xué)性狀的關(guān)聯(lián)性，我們可以通過研究生物大分子之間的相互作用來奠定前期工作基礎(chǔ)。原子力顯微鏡(Atomic Force Microscope，AFM)作為上個(gè)世紀(jì)80年代發(fā)明的一種獲取物體表面納米尺度信息的工具，為細(xì)胞與亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)及相互作用力的相關(guān)研究提供了強(qiáng)有力的技術(shù)手段。
　　我們?cè)诒狙芯恐兄饕肁FM的技術(shù)特點(diǎn)，初步分析在大氣和液體環(huán)境中對(duì)不同樣品進(jìn)行形態(tài)學(xué)上的掃描研究，對(duì)于AFM在液體條件中的操作條件進(jìn)行優(yōu)化對(duì)比。以此來考查

3、在接近生理?xiàng)l件的緩沖溶液環(huán)境下，利用AFM來進(jìn)行檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，并優(yōu)化在液相環(huán)境中對(duì)樣品進(jìn)行形貌掃描分析的操作條件。同時(shí)我們利用天然的云母片、醛基修飾的玻璃片等，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)特征進(jìn)行研究，從而為了在研究生物樣品時(shí)，可以選擇更加適用于液體環(huán)境操作的AFM基底。在原子力顯微鏡研究生物樣品的操作中，常用的基底材料一般采用化學(xué)修飾的基底或者云母片。云母片表面具有電荷，固定樣品可以通過靜電吸附作用來實(shí)現(xiàn)，而樣品通過化學(xué)修飾到基底表面和云母片的靜電吸附

4、相比較，化學(xué)修飾可以增加基底表面結(jié)合的生物樣品數(shù)量，同時(shí)共價(jià)鍵的作用力大于靜電吸附，因此，我們需要參考進(jìn)行下一步研究的目的和方案，來進(jìn)行基底材料的選擇。為后期工作利用AFM在接近生理的條件下研究生物大分子間的相互作用，形態(tài)活性，以及研究一些重要的生物學(xué)動(dòng)態(tài)過程，提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。另外，通過我們的研究發(fā)現(xiàn)，AFM在液體條件下可以消除表面毛細(xì)作用和靜電力的干擾，因此在液體條件中所得的樣品形貌圖像更能反映出被測(cè)樣品的真實(shí)狀態(tài)。
　　其

5、次我們對(duì)AFM在氣相和液相條件下的探針力-距離曲線進(jìn)行了分析比對(duì)，并以此測(cè)量生物大分子間的相互作用力。同時(shí)，我們對(duì)實(shí)驗(yàn)過程中的技術(shù)操作問題進(jìn)行了改進(jìn)，如減少溫漂問題、彈性系數(shù)精準(zhǔn)測(cè)量的方法、Trigger mode的選擇、XY方向大范圍內(nèi)閉環(huán)系統(tǒng)的選擇、控制的多樣性優(yōu)化選擇。在力-距離曲線的測(cè)量中，由于采集的數(shù)據(jù)是通過AFM探針與基底彈性力的改變實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)后得出的，為了解決數(shù)據(jù)信息量大的問題，我們選擇聚類分析算法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。對(duì)k-mea

6、ns算法的深入分析過程中發(fā)現(xiàn)選擇適當(dāng)?shù)某跏假|(zhì)心是k-means算法執(zhí)行過程的關(guān)鍵步驟，因此我們對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)，對(duì)數(shù)據(jù)分析的算法程序進(jìn)行了改編，為解析生理?xiàng)l件下生物分子之間的相互作用力及生物反應(yīng)過程中的動(dòng)力學(xué)奠定初步的數(shù)據(jù)分析手段。原子力顯微鏡在液相條件下進(jìn)行分子間作用力測(cè)量的操作中，我們針對(duì)實(shí)驗(yàn)過程中的技術(shù)操作及數(shù)據(jù)處理方面進(jìn)行了優(yōu)化，通過改變實(shí)驗(yàn)條件降低了溫飄的影響，通過液體動(dòng)力學(xué)模型對(duì)彈性系數(shù)進(jìn)行精確測(cè)量，選用trigger mode

7、模式來消除基底的影響，選取XY方向大范圍內(nèi)閉環(huán)系統(tǒng)來增大掃描范圍，降低位置漂移，改變多個(gè)參量，達(dá)到多樣化的控制;同時(shí)對(duì)k-means算法進(jìn)行了程序上的改進(jìn)，這不同于實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，而是針對(duì)控制程序進(jìn)行的改良。
　　第三，目前的實(shí)驗(yàn)手段在針對(duì)DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)的研究中，還無法測(cè)量出與解鏈溫度直接相關(guān)的雜交雙鏈的成鏈親和力，無法分辨出互補(bǔ)雜交雙鏈的鏈間相互作用和鏈內(nèi)相互作用，也就是雙鏈DNA分子間的氫鍵結(jié)合力和堿基堆積力。為了能夠在

8、分子水平上全面系統(tǒng)地認(rèn)識(shí)基因探針-靶標(biāo)核酸雜交雙鏈的成鍵特性，認(rèn)識(shí)基因探針對(duì)靶標(biāo)核酸和非靶標(biāo)核酸的辨異能力，我們利用原子力顯微鏡測(cè)量基因探針與靶標(biāo)核酸相互結(jié)合時(shí)的力-距離曲線，并由此導(dǎo)出最直接的物理參數(shù):氫鍵結(jié)合力和堿基堆積力。以自行設(shè)計(jì)的兩種測(cè)量模式為基礎(chǔ)，即解螺旋模式和拉伸模式分別測(cè)量DNA雙鏈的成鍵特性，并計(jì)算出氫鍵結(jié)合力和堿基堆積力。有關(guān)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中堿基堆積力的測(cè)量，這方面的工作還未見報(bào)道，多見的是氫鍵結(jié)合力的測(cè)量，我們?cè)O(shè)

9、計(jì)模式中的拉伸模式即對(duì)應(yīng)于堿基堆積力的測(cè)量。在形成DNA雙螺旋的過程中，NaCl濃度的影響是至關(guān)重要的，而文獻(xiàn)中對(duì)于鹽濃度的選擇并無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn);同時(shí)，對(duì)于探針在基底表面的停留時(shí)間以及探針的加載速度也無準(zhǔn)確的報(bào)道，這些不確定因素導(dǎo)致文獻(xiàn)中，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵結(jié)合力測(cè)量數(shù)據(jù)的不一致性。因此，我們?cè)谶M(jìn)行雙鏈DNA分子互補(bǔ)雜交雙鏈的鏈間相互作用和鏈內(nèi)相互作用的測(cè)量中，對(duì)上述條件進(jìn)行了選擇性優(yōu)化，從而得出在目前條件下比較穩(wěn)定的測(cè)量方法，并推導(dǎo)

10、出雙鏈DNA分子間的氫鍵結(jié)合力和堿基堆積力。這種pN級(jí)力的數(shù)據(jù)積累，對(duì)于研究病理?xiàng)l件下雙鏈DNA分子間作用力的變化具有指導(dǎo)意義。在利用原子力顯微鏡進(jìn)行雙鏈DNA分子間的氫鍵結(jié)合力和堿基堆積力測(cè)量的時(shí)候，我們?cè)O(shè)計(jì)了含有10、14、20bp堿基對(duì)的寡核苷酸序列，形成G-C及A-T完全匹配的互補(bǔ)序列，通過對(duì)探針表面及醛基玻片基底分別進(jìn)行化學(xué)修飾，并利用解螺旋模式和拉伸模式進(jìn)行測(cè)量，選擇NaCl濃度為100mM，探針在基底表面停留時(shí)間為10s、