氟他胺誘導(dǎo)大鼠干眼模型的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究擬通過制作雄激素受體拈抗劑氟他胺誘導(dǎo)的大鼠干眼模型，觀察大鼠淚液分泌量、淚膜穩(wěn)定性、眼表組織病理學(xué)變化;通過免疫組織化學(xué)方法檢測腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素-1α(interleukin-1α，IL-1α)在角膜、結(jié)膜、淚腺和瞼板腺上皮的表達(dá)，探討雄激素受體拮抗劑氟他胺導(dǎo)致干眼的發(fā)病機(jī)制，分析該模型的科學(xué)性及實(shí)用性，并為干眼的治療提供理論依據(jù)。
　　第一部分 氟他

2、胺誘導(dǎo)大鼠干眼模型的建立
　　目的：
　　建立雄激素受體拮抗劑氟他胺誘導(dǎo)的大鼠干眼動(dòng)物模型，為進(jìn)一步探討雄激素在干眼發(fā)病機(jī)制中的作用提供基礎(chǔ)。
　　方法：
　　清潔級(jí)健康成年SD雌性大鼠32只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為高濃度組、中濃度組、低濃度組和對照組，每組各8只。高、中、低濃度組分別用濃度為16mg·kg-1·d-1、13mg·kg-1·d-1、10 mg·kg。1·d-1氟他胺溶液灌胃，對照組1ml·d-1生理

3、鹽水灌胃，每組分別于給藥前和給藥后2、4、8、16、20周測干眼臨床指標(biāo):淚液分泌試驗(yàn)(SchirmerⅠ test，SⅠt)、淚膜破裂時(shí)間(tear firm break-up time，BUT)及角膜熒光素鈉染色評(píng)分。造模成功標(biāo)準(zhǔn):給藥后20周時(shí)高、中、低濃度組大鼠的干眼臨床指標(biāo)與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每組分別于給藥前、給藥后10、20周行心臟穿刺取血，采用放射免疫法測量血清睪酮及雌二醇濃度。使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件數(shù)

4、據(jù)分析，描述性統(tǒng)計(jì)值用(X)+S表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.SchirmerⅠ test:給藥后4周時(shí)高濃度組(8.20±0.58mm)、中濃度組(8.53±0.34mm)SⅠ t值開始減少，與對照組(9.84±0.54mm)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);8周時(shí)高濃度組(7.13±0.25mm)、中濃度組(7.04±0.47mm)、低濃度組(8.43±0.67mm)的SⅠt值均少于對照

5、組(9.94±0.43mm)(P＜0.05);隨著時(shí)間延長，20周時(shí)高濃度組(3.23±0.31 mm)、中濃度組(3.98±0.36mm)、低濃度組(4.73±0.18mm)的SⅠt值進(jìn)一步減少，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且均較對照組(9.60±0.60mm)下降大于50％(P＜0.05)。
　　2.BUT:給藥后4周時(shí)高濃度組(6.80±1.05s)大鼠即出現(xiàn)BUT縮短，分別與低濃度組(8.63±0.65s)

6、、對照組(9.25±1.03s)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);8周時(shí)，高濃度組(5.20±0.58s)、中濃度組(7.21±0.56s)、低濃度組(8.32±0.37s)的BUT兩兩比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且均短于對照組(10.70±1.07s)(P＜0.05);20周時(shí)高(2.40±0.61s)、中(4.32±0.68s)、低(6.10±0.81s)濃度組的BUT較對照組(9.12±0.73s)進(jìn)一步縮短，各

7、組之間兩兩比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　3.角膜熒光素鈉染色:給藥后4周時(shí)高、中濃度組開始出現(xiàn)角膜上皮點(diǎn)狀熒光素鈉著色;8周時(shí)角膜熒光素鈉染色評(píng)分高濃度組(6.80±0.79)、中濃度組(4.13±0.53)分別與低濃度組(2.50±1.08)、對照組(0.56±1.30)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);16周時(shí)高濃度組可見彌漫性大片狀著色，中、低濃度組角膜上皮出現(xiàn)小片狀著色，隨時(shí)間延長高、中、低濃度組角

8、膜熒光素鈉染色評(píng)分逐漸加重，20周時(shí)高濃度組(9.05±0.49)、中濃度組(7.21±0.57)、低濃度組(4.82±0.47)、對照組(1.05±1.13)染色評(píng)分兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.性激素水平:給藥后10周時(shí)高濃度組（4.38±0.68pg·ml-1）、中濃度組（3.56±0.53pg·ml-1）的血清睪酮濃度開始升高，分別與對照組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);20周時(shí)高濃度組（

9、5.08±0.21pg·ml-1）、中濃度組（4.23±0.16pg·ml-1）、低濃度組（3.58±0.24pg·ml-1）血清睪酮濃度較對照組(2.24±0.15pg·ml-l)不同程度升高，兩兩比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。給藥后10、20周時(shí)高、中、低濃度組血清雌二醇濃度較對照組均無明顯差異(P＞0.05)，各組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　雄激素受體拮抗劑氟他胺溶液灌胃可以

10、成功建立混合型干眼模型，且干眼的嚴(yán)重程度呈時(shí)間和藥物濃度依賴性。
　　第二部分 氟他胺誘導(dǎo)大鼠干眼模型的機(jī)制研究
　　目的：
　　探討氟他胺誘導(dǎo)大鼠干眼模型的作用機(jī)制。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組同第一部分。20周后麻醉下處死各組動(dòng)物，取角膜、結(jié)膜、淚腺和瞼板腺組織HE染色觀察各上皮病理組織變化，并采用免疫組織化學(xué)方法檢測TNF-α、IL-1α在各組織上皮的表達(dá)。每張切片選取5個(gè)200倍視野進(jìn)行拍照，并

11、用Image-Pro Plus分析軟件對照片進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件數(shù)據(jù)分析，描述性統(tǒng)計(jì)值用X±S表示，TNF-α、IL-1α的表達(dá)量用單因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.角膜組織病理學(xué)觀察:高、中、低濃度組角膜出現(xiàn)不同程度鱗狀上皮層次明顯增加，排列紊亂且可見表層細(xì)胞不規(guī)則缺失，翼狀細(xì)胞及基底細(xì)胞排列紊亂，基質(zhì)層水腫，高濃度組病變最顯著。

12、對照組角膜上皮細(xì)胞層次正常較扁平，表層細(xì)胞不角化，翼狀上皮細(xì)胞呈多角形，基底細(xì)胞排列整齊。
　　2.淚腺組織病理學(xué)觀察:高、中、低濃度組出現(xiàn)不同程度淚腺上皮細(xì)胞扁平萎縮小而密集、胞漿淡染，可見空泡，細(xì)胞排列紊亂，腺腔擴(kuò)大。腺泡萎縮融合，大小不一，結(jié)構(gòu)排列紊亂，高濃度組改變最為顯著。對照組可見結(jié)締組織深入實(shí)質(zhì)將腺組織分割成小葉，邊界清晰而規(guī)則的腺泡細(xì)胞大小均勻，內(nèi)層是柱狀上皮細(xì)胞，核位于基底部。
　　3.結(jié)膜組織病理學(xué)觀察:高

13、、中、低濃度組出現(xiàn)不同程度結(jié)膜上皮細(xì)胞層數(shù)增多，層次間模糊，排列紊亂呈角化狀，基底層細(xì)胞排列不整齊，可見炎性細(xì)胞浸潤。對照組結(jié)膜上皮細(xì)胞排列規(guī)則，無角化及炎性細(xì)胞浸潤。
　　4.瞼板腺組織病理學(xué)觀察:高、中、低濃度組出現(xiàn)不同程度瞼板腺腺體萎縮融合，鱗狀上皮化生，腺管壁增厚，基底細(xì)胞變薄，腺管周圍纖維化和腺管開口擴(kuò)張。對照組瞼板腺可見邊界清晰而規(guī)則的腺細(xì)胞，大小均勻排列整齊，腺管呈一同心圓狀，管壁厚度正常。
　　6.角膜中TN

14、F-α、IL-1α的表達(dá):免疫組化結(jié)果顯示高、中、低濃度組TNF-α、IL-1α大量表達(dá)于角膜上皮細(xì)胞胞漿及少量表達(dá)于基質(zhì)層，對照組微量表達(dá)。高、中、低濃度組每1000個(gè)角膜上皮細(xì)胞中TNF-α、IL-1α陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)明顯高于對照組(P＜0.05)。高、中濃度組角膜上皮TNF-α、IL-1α的陽性細(xì)胞數(shù)相對低濃度組較高(P＜0.05)。
　　7.淚腺中TNF-α、IL-1α的表達(dá):免疫組化結(jié)果顯示高、中濃度組TNF-α、IL-

15、1α大量表達(dá)于淚腺腺泡上皮細(xì)胞胞漿，低濃度組可見中量表達(dá)，對照組少量表達(dá)。高、中、低濃度組每1000個(gè)淚腺細(xì)胞中TNF-α、IL-1α陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)明顯高于對照組(P＜0.05）。高、中濃度組淚腺上皮TNF-α的陽性細(xì)胞數(shù)相對低濃度組較高（P＜0.05），但高、中濃度組間比較，差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.01）。高、中、低濃度組的IL-1α陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　8.瞼板腺中TNF-α、

16、IL-1α的表達(dá):免疫組化結(jié)果顯示高、中、低濃度組TNF-α、IL-1α大量表達(dá)于瞼板腺腺泡細(xì)胞胞漿，對照組少量表達(dá)。高、中、低濃度組每1000個(gè)瞼板腺腺泡細(xì)胞中TNF-α、IL-1α陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)明顯高于對照組(P＜0.05）。高、中濃度組TNF-α、IL-1α的陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)相對低濃度組較高(P＜0.05)，但高、中濃度組間比較，差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.01)。
　　9.結(jié)膜中TNF-α、IL-1α的表達(dá):免疫組化結(jié)果顯

17、示高、中、低濃度組TNF-α、IL-1α大量表達(dá)于結(jié)膜上皮細(xì)胞胞漿，微量表達(dá)于固有層，對照組少量表達(dá)于結(jié)膜上皮細(xì)胞胞漿。高、中、低濃度組每1000個(gè)結(jié)膜上皮細(xì)胞中TNF-α、IL-1α陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)明顯高于對照組(P＜0.05)。高、中、低濃度組TNF-α的陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。高濃度組IL-1α的陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)相對低濃度組較高(P＜0.05)，但高、中濃度組以及中、低濃度組間比較，差異均無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)