發(fā)酵液中γ-聚谷氨酸的分離純化及初步鑒定研究.pdf

1、γ-聚谷氨酸(Poly-γ-glutamic acid，γ-PGA)是一種具有生物相容性、生物可降解性、無(wú)毒無(wú)污染等特點(diǎn)的高分子聚合物。與化學(xué)合成法、酶轉(zhuǎn)化法、提取法相比，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)γ-PGA工藝簡(jiǎn)單、產(chǎn)量較高，因此成為生產(chǎn)γ-PGA的主要途徑。但是γ-PGA發(fā)酵液成分復(fù)雜、黏度高，所以從發(fā)酵液中分離純化γ-PGA成為研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。
　　傳統(tǒng)分離純化γ-PGA的方法有有機(jī)溶劑沉淀法、化學(xué)沉淀法、膜分離法，前兩種方法提取率

2、低、純度低，膜分離法存在膜易堵塞、成本高的問(wèn)題。為彌補(bǔ)以上缺點(diǎn)，本課題旨在通過(guò)選擇合適的雙水相體系(Aqueous two-phasesystem，ATPS)來(lái)達(dá)到從發(fā)酵液中有效地分離提取γ-PGA的目的。利用PEG-鹽雙水相體系、有機(jī)溶劑-鹽雙水相體系和離子液體-鹽雙水相體系從發(fā)酵液中提取γ-PGA，研究工藝條件和環(huán)境因素對(duì)提取率Y的影響，并對(duì)γ-PGA進(jìn)行初步鑒定。主要研究?jī)?nèi)容與結(jié)果如下:
　　(1)考察不同PEG-無(wú)機(jī)鹽雙水

3、相體系對(duì)γ-PGA的萃取能力，結(jié)果表明PEG2000-磷酸鉀鹽ATPS對(duì)γ-PGA的提取率最高。通過(guò)對(duì)工藝條件和環(huán)境因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)分析，確定了γ-PGA的最佳提取條件:PEG2000質(zhì)量分?jǐn)?shù)22％、磷酸鉀鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)14％，磷酸鹽緩沖液pH值為7.5、添加1.2％(w/w)的NaCl，室溫條件下自然分相時(shí)間小于5min，此條件下系統(tǒng)的分配系數(shù)為0.10，下相收率為96.02％。
　　(2)考察不同有機(jī)溶劑-無(wú)機(jī)鹽雙水相

4、體系對(duì)γ-PGA的萃取能力，結(jié)果表明正丙醇-Na2CO3ATPS對(duì)γ-PGA的提取率最高。通過(guò)對(duì)工藝條件和環(huán)境因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)分析，確定了γ-PGA的最佳提取條件:正丙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)18％、碳酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)14％，體系pH值為10、萃取溫度40℃、分相時(shí)間為2.5h，此條件下系統(tǒng)的分配系數(shù)為0.23，下相收率為98.07％。
　　(3)考察不同離子液體-無(wú)機(jī)鹽雙水相體系對(duì)γ-PGA的萃取能力，結(jié)果表明[C4mim]Cl-K2

5、HPO4ATPS對(duì)γ-PGA的提取率最高?？疾炝薣C4mim]Cl濃度、K2HPO4的加入量、pH、溫度對(duì)γ-PGA提取率的影響，選擇出[C4mim]Cl濃度、K2HPO4的加入量、pH三因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化最佳提取條件。篩選出的最佳條件:[C4mim]Cl濃度為404.58mg/mL、K2HPO4加入量為1.51 g、pH為8.96，此時(shí)預(yù)測(cè)的γ-PGA上相收率為97.45％。根據(jù)生產(chǎn)實(shí)際將提取條件調(diào)整為[C4mim]Cl濃度

6、為404mg/mL、K2HPO4加入量為1.5g、pH為9.0。對(duì)提取條件進(jìn)行驗(yàn)證，得到γ-PGA上相收率為96.63％，與理論預(yù)測(cè)值相近，說(shuō)明模型的可信度高。通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)還可以得到這三個(gè)因素對(duì)γ-PGA提取率影響的強(qiáng)弱順序:pH＞K2HPO4加入量＞[C4mim]Cl濃度。
　　(4)綜合考慮萃取效果、成本和工業(yè)可行性，最終選擇正丙醇-Na2CO3雙水相體系提取發(fā)酵液中的γ-PGA。將下相溶液透析、冷凍干燥后，得到乳白色粉末。

7、茚三酮比色法結(jié)果表明γ-PGA的純度為56.85％，紙層析結(jié)果表明發(fā)酵得到的γ-PGA是由單一的谷氨酸組成，不含有其他游離氨基酸。SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果表明γ-PGA的分子量范圍在669kDa-700kDa之間，是一種多分子量聚合物。
　　(5)對(duì)γ-PGA進(jìn)行保水性和吸水性研究，保水性研究結(jié)果表明γ-PGA確實(shí)有保水性，而且濃度越大，保水性越強(qiáng);吸水性研究結(jié)果表明經(jīng)過(guò)紫外線照射的γ-PGA的吸水性增強(qiáng)，且照射時(shí)間越長(zhǎng)，吸水