重構(gòu)樹干畢赤酵母合成菌株利用木糖生產(chǎn)富馬酸.pdf

1、富馬酸是一種重要的四碳二羧酸平臺化合物，被美國能源部列為二十一世紀優(yōu)先發(fā)展的12種平臺化合物之一，廣泛用于化工、醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域中。根霉屬菌株是富馬酸的主要生產(chǎn)者，然而由于其具有復雜的生長形態(tài)，較低的特異性重組頻率，以及缺少有效的基因操作工具，利用基因工程手段對其進行改造仍很困難，從而限制了富馬酸產(chǎn)量的提高。木質(zhì)纖維素是自然界最豐富的可再生資源，木糖是木質(zhì)纖維素的重要組成部分，是繼葡萄糖之后自然界最豐富的糖類，有效利用木糖是木質(zhì)纖維素開

2、發(fā)利用的關(guān)鍵。
　　本文首次通過合成生物學的方法，以具有優(yōu)秀木糖代謝能力的樹干畢赤酵母（Scheffersomyces stipitis）為宿主，異源表達來自米根霉的富馬酸還原合成途徑，包括丙酮酸羧化酶（RoPYC）、蘋果酸脫氫酶（RoMDH）和富馬酸酶（RoFUM1），構(gòu)建了S. stipitis富馬酸初始合成菌株P(guān)SRPMF。在微氧條件下，以50 g/L木糖為底物，經(jīng)過96 h發(fā)酵，富馬酸產(chǎn)量達到1.86 g/L。
　　

3、為了提高富馬酸產(chǎn)量，本文對富馬酸初始合成菌株的發(fā)酵行為進行理性分析，發(fā)現(xiàn)其在富馬酸生產(chǎn)過程中的主要障礙，并依次對富馬酸合成途徑活性、碳代謝流分配和轉(zhuǎn)運途徑三個關(guān)鍵過程進行了理性優(yōu)化。首先根據(jù)樹干畢赤酵母的密碼子偏好性，將來自米根霉的富馬酸合成途徑進行密碼子優(yōu)化，使丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶和富馬酸酶活性分別提高了28.12％、17.35%和16.13%，相對表達量分別提高了35.39%、20.29%和18.75%，富馬酸產(chǎn)量達到2.65

4、g/L；其次，通過敲除自身富馬酸酶(Psfum1和Psfum2)，調(diào)節(jié)碳代謝流分配，減少富馬酸消耗，使富馬酸產(chǎn)量提高至3.21 g/L；再次，為了進一步促進胞內(nèi)富馬酸轉(zhuǎn)運至胞外，構(gòu)建了異源高效富馬酸轉(zhuǎn)運途徑Y(jié)MAE1(來自栗酒裂殖酵母SpMAE1)，提高了富馬酸轉(zhuǎn)運能力，使胞內(nèi)富馬酸含量降低了43.75%，達到0.36 mg/g DCW，促進了富馬酸合成；最終獲得了能夠利用木糖高效生產(chǎn)富馬酸的樹干畢赤酵母合成菌株P(guān)SYPMFfS，在微氧