脂肪酶催化制備中碳鏈結(jié)構(gòu)脂和阿魏酰結(jié)構(gòu)磷脂.pdf

1、中碳鏈結(jié)構(gòu)脂具有供能及時，改善人體對長碳鏈脂肪酸的吸收，滿足人體對必需脂肪酸的需求，彌補長碳鏈甘三酯和中碳鏈甘三酯的缺陷等優(yōu)點，其為制備腸道藥品和腸胃營養(yǎng)品脂肪乳的重要原材料。中碳鏈結(jié)構(gòu)脂特殊的脂肪酸定位分布，傳統(tǒng)的化學催化劑難以勝任其制備工作，脂肪酶以其具有位置選擇性、反應條件溫和等優(yōu)點成為制備中碳鏈結(jié)構(gòu)脂的重要生物催化劑。但目前報道的酶法制備中碳鏈結(jié)構(gòu)脂方法中存在脂肪酶價格高，底物侵蝕脂肪酶致其失活和批式反應中原料及能耗大等缺陷。本

2、文主要針對以上存在的問題進行了如下研究。
　　阿魏酸(Ferulicacid，F(xiàn)A)是一種天然的抗氧化劑，具有清除自由基、保護細胞、抑制血栓素釋放、抗癌、抗菌消炎等功能，廣泛應用于食品、醫(yī)藥及化妝品等領(lǐng)域。但由于FA在油相和水相體系中的溶解度都較低，很難滲透進入生物脂質(zhì)層發(fā)揮作用，因此FA衍生物的制備成為熱點問題。磷脂是細胞膜的基本組成成分，對維持細胞的通透性和細胞內(nèi)氧的傳遞起著重要作用。若將FA分子結(jié)合到磷脂分子上，可以有效解決

3、其生物利用度低的問題，同時可以保證FA的生理活性不受影響。由于FA和磷脂均為熱敏性物質(zhì)，本文利用脂肪酶催化制備阿魏酰結(jié)構(gòu)磷脂(FLPs)，同時對其合成路線、反應介質(zhì)的選擇、結(jié)構(gòu)表征及反應條件的優(yōu)化進行了研究。
　　在無溶劑體系下，選擇以中碳鏈脂肪酸（辛酸、癸酸）為?；w、以LipozymeRMIM為最佳生物催化劑制備中碳鏈結(jié)構(gòu)脂?；谀繕水a(chǎn)物的特定要求（如配方FE73403），考察了不同反應條件，包括脂肪酸摩爾比、底物摩爾比、反

4、應溫度、加酶量、酶的重復利用次數(shù)，對脂肪酸插入率的影響。在反應條件為辛酸、癸酸摩爾比4∶1，底物（酸/大豆油）摩爾比6∶1，溫度55℃，加酶量7wt％（以總底物質(zhì)量計），反應4h可達到目標配方FE73403的要求，并且酶可以重復利用12次以上。用分子蒸餾法對產(chǎn)品進行了分離純化，分餾產(chǎn)品的甘三酯含量達90％以上，羥值為9.71，脂肪酸組成及sn-2脂肪酸組成符合目標配方FE73403要求。另外，對該反應的反應動力學及反應機制進行了研究。反

5、應的活化能為21.1kJ/mol，酶促反應動力學參數(shù)Km和Vm分別為2.28mol/L和18.52mol/(L×min)。
　　為了降低底物對固定化脂肪酶載體的侵蝕，增加脂肪酶的催化活性，建立了新的反應體系，以實驗室自制中碳鏈脂肪酸乙酯（純度達90％以上）為?；w、以價格便宜的脂肪酶LipozymeTLIM為生物催化劑制備中碳鏈結(jié)構(gòu)脂?；谀繕伺浞紽E73403，考察了不同反應條件，包括脂肪酸乙酯摩爾比、底物摩爾比、反應溫度、加

6、酶量，對脂肪酸插入率的影響。在反應條件為辛酸乙酯、癸酸乙酯摩爾比3∶1，底物（乙酯/大豆油）摩爾比6∶1，反應溫度60℃，加酶量13wt％（以總底物質(zhì)量計），反應可較快達到目標配方FE73403的要求。同時考察了脂肪酶的重復利用次數(shù)，當反應進行12批次(每批次12h)時，脂肪酶的活力降低明顯，該酶穩(wěn)定性有待進一步提高。該反應的活化能為30.1kJ/mol，酶促反應動力學參數(shù)Km和Vm分別為4.02mol/L和4.94mol/(L×min

7、)。
　　為了有效解決批式反應中原料、能耗大及生產(chǎn)能力低等問題，本文利用中碳鏈甘三酯(MCT)為酰基供體，設計并組裝了固定床連續(xù)反應裝置，優(yōu)化了連續(xù)法制備中碳鏈結(jié)構(gòu)脂的工藝參數(shù)，對脂肪酶的穩(wěn)定性進行了考察，并用不同極性的溶劑（丙酮、異丙醇、叔丁醇和異丁醇）處理使用過的脂肪酶，對酶的循環(huán)使用進行了研究。通過批式反應中比較了兩種酶的催化性能，盡管LipozymeRMIM的sn-1，3位專一性較好，但LipozymeTLIM具有明顯的價

8、格優(yōu)勢，后續(xù)研究采用價格低廉的脂肪酶LipozymeTLIM。連續(xù)反應最佳保留時間及反應溫度為30-40min和55℃，在此條件下，連續(xù)反應204h后，LipozymeTLIM酶活損失較大，經(jīng)丙酮處理后，該酶至少可循環(huán)使用四批次，可使反應的轉(zhuǎn)酯化度從40％提高至55％左右。
　　本文初步建立了以磷脂酰膽堿(PC)與阿魏酸乙酯(EF)為底物脂肪酶催化制備FLPs的反應體系以及定性定量分析產(chǎn)物的方法，開發(fā)了一條兩步酶法制備FLPs的反

9、應路線:第一步在脂肪酶催化下水解底物PC制得溶血磷脂酰膽堿(LPC)和甘油磷脂酰膽堿(GPC)，第二步將EF加入上述反應體系中，在脂肪酶催化下制備FLPs。對不同來源的脂肪酶及反應體系進行了篩選，最佳生物催化劑和反應介質(zhì)分別為Novozym435和甲苯。利用制備型高效液相色譜制備了高純產(chǎn)物—1-阿魏酰-溶血磷脂酰膽堿(1-FLP)，通過TLC、HPLC、LC-MS和核磁共振對產(chǎn)物進行了結(jié)構(gòu)鑒定，確定了合成產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)為1-FLP。

10、r>　　對利用PC和EF為底物制備FLPs的反應條件進行了單因素優(yōu)化，最佳反應條件為:甲苯/三氯甲烷(90∶10，v/v)5mL，PC最佳水解時間1.5h，底物摩爾比(PC∶EF)5∶1，最佳脂肪酶Novozym435用量60mg/mL，反應溫度55℃，4(A)分子篩100mg/mL。在最佳反應條件下反應4天，F(xiàn)LPs轉(zhuǎn)化率可提高至40.15±1.25％。通過響應面曲線法對反應條件進行了綜合優(yōu)化，最佳反應條件是:底物摩爾比5∶1，PC水