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文檔簡介
1、細菌在給人類帶來益處的同時,也時刻威脅著人類的生活和健康。面對致病菌的威脅,抗生素的使用必不可少。然而,隨著細菌耐藥性的愈演愈烈以及有效抗生素的日趨減少,開發(fā)不依賴于傳統(tǒng)抗生素結(jié)構(gòu)修飾或改造的新型抗菌材料具有十分重要的意義。針對這個問題,本研究在比較了現(xiàn)有無機抗菌劑和有機抗菌劑后,選擇高分子抗菌材料為研究對象,以哌嗪(PA)和乙二胺四乙酸二酐(EDTAD)為原料設計并制備了一種具有獨特結(jié)構(gòu)的新型哌嗪聚合物PE。首先,利用傅立葉變換紅外光
2、譜儀(FTIR)、核磁共振波譜儀( NMR)、元素分析儀(EA)、差示掃描量熱計(DSC)、熱重分析(TG)以及光學顯微鏡等對其基本結(jié)構(gòu)和性能進行了系統(tǒng)表征;接著,考察了PE對革蘭氏陽性菌-金黃色葡萄球菌(S.aureus)和革蘭氏陰性菌-大腸桿菌(E.coli)及相應生物膜形成過程的影響;然后,利用掃描電鏡(SEM)、透射電鏡(TEM)、FTIR、紫外分光光度計(UV)、酶標儀、凝膠電泳等對PE的抗菌作用機理進行了探討;最后,采用SD
3、大鼠乳鼠顱蓋骨成骨細胞檢測了PE的細胞毒性。在對PE的抗菌性能和細胞毒性進行了系統(tǒng)的評價后,本研究進一步將與成骨細胞功能表達相關的生物活性因子MGF-Ct24E引入到PE的分子結(jié)構(gòu)中以期制備出另一種具有更小細胞毒性的新型抗菌性哌嗪聚合物PEM。對于所獲得的產(chǎn)物,采用FTIR、NMR、EA、氨基酸分析儀(AAA)、DSC及TG等對其基本結(jié)構(gòu)和性能進行了表征;然后,評價了PEM的體外抗菌性能和細胞毒性,并與PE進行了系統(tǒng)的比較;最后,將兩種
4、新型哌嗪聚合物PE和PEM與具有良好生物相容性和骨傳導性的多孔羥基磷灰石(HA)陶瓷支架進行復合,并對所得復合物的抗菌性能和生物相容性進行了初步評價。主要研究內(nèi)容和結(jié)論如下所述:
?、僖訮A和EDTAD為原料通過一種簡單且綠色的方法制備了一種新型的哌嗪聚合物PE:
1)FTIR、13C NMR和EA的分析結(jié)果表明,PE分子中的PA和EDTAD基本以1:1進行反應,最后形成了兩端為羧基封端的聚合物。
2)熱分析
5、結(jié)果顯示PE的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg)為50.09℃,熱分解溫度為200℃。
3)當PE溶液處于較低溫度時,由于分子內(nèi)和分子間氫鍵的作用,會形成直徑約為5μm的凝膠,而隨著溫度的升高(45℃),該凝膠態(tài)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槿芤簯B(tài)。
②將新型哌嗪聚合物PE作用于E.coli和S.aureus,以考察其相應的抗菌性能,檢測指標主要包括:細菌敏感性、MIC和 MBC值,細菌生長抑制情況以及與細菌生物膜形成過程相關的游離細菌和粘附細菌的
6、快速殺滅作用,細菌生物膜生長抑制情況等。除此之外,還考察了環(huán)境因素對PE抗菌性能的影響。所得結(jié)果如下所示:
1)與環(huán)丙沙星對照組相比,PE能夠更好地抑制和殺滅E.coli和S.aureus,且其對E.coli的作用效果更明顯。
2)PE對E.coli和S.aureus的MIC值受到環(huán)境 pH值和最初細菌接種量的影響,具體表現(xiàn)為:隨著環(huán)境pH值的上升,PE對兩種細菌的MIC值均呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢;隨著兩種細菌初始
7、接種量的增加,PE相應的MIC值增大。
3)PE能夠顯著的影響細菌生物膜的形成過程,具體表現(xiàn)為:與環(huán)丙沙星對照組相比,PE能夠濃度依賴性的對游離細菌和粘附細菌起到更好的快速殺滅作用,且其對細菌生物膜生長的抑制作用與環(huán)丙沙星對照組相當。
?、蹖⒁欢舛鹊腜E作用于E.coli和S.aureus一段時間后,采用SEM和TEM觀察細菌形態(tài)的變化;采用FTIR和UV檢測細菌細胞壁結(jié)構(gòu)成分的改變;檢測培養(yǎng)液中K+和Mg2+的濃度
8、以及乳酸脫氫酶(LDH)和β-半乳糖苷酶的活性等以考察PE對細菌細胞膜完整性的影響;檢測菌體內(nèi)DNA的含量和破損情況以了解PE對細菌遺傳物質(zhì)的影響。結(jié)果如下所示:
1)PE會直接作用于細菌的細胞壁和細胞膜,破壞其結(jié)構(gòu),并使得細菌內(nèi)容物泄漏,DNA丟失。
2)PE會直接作用于細菌的遺傳物質(zhì)DNA,使其發(fā)生斷裂,并最終影響細菌的分裂增殖。
④將PE與SD大鼠乳鼠顱蓋骨成骨細胞進行體外培養(yǎng),以檢測其細胞毒性,具體
9、包括PE對成骨細胞形態(tài)、鋪展、增殖、周期、分化及礦化的影響,所得結(jié)果如下所示:
1)PE作用于成骨細胞4h后幾乎不會對其鋪展造成影響,而隨著培養(yǎng)時間延長到24h時,PE對成骨細胞鋪展的影響呈現(xiàn)出濃度依賴性,但是均優(yōu)于環(huán)丙沙星對照組。
2)PE會濃度依賴性地抑制成骨細胞的增殖;其主要作用方式包括:一、當PE濃度達到一定值后,會對成骨細胞的鋪展造成影響,并減少最初粘附的細胞數(shù)目;二、阻礙成骨細胞進入S期,堆積在G1期,從
10、而出現(xiàn)G2/M期阻滯現(xiàn)象,并最終導致成骨細胞的增殖受到抑制。
3)PE會濃度依賴性地影響成骨細胞的成熟、分化和礦化,且其抑制作用小于環(huán)丙沙星對照組。
?、菰谙到y(tǒng)地評價了PE的體外抗菌性能和細胞毒性后,以EDC和NHS為縮合劑,將力生長因子MGF-Ct24E引入到PE的分子結(jié)構(gòu)中從而制備出了另一種新型哌嗪聚合物PEM:
1)FTIR、13C NMR、EA和AAA的分析結(jié)果表明,MGF-Ct24E已經(jīng)在PE中成功
11、引入,且其含量約為1.39μmol/g。
2)熱分析結(jié)果顯示PEM的Tg為36.56℃,熱分解溫度為315℃。
?、逌y試了PEM的體外抗菌活性和細胞毒性,并與PE進行了系統(tǒng)的比較,所得結(jié)果如下所示:
1)與PE相比,PEM對E.coli和S.aureus的MIC值和MBC值有所增加,但是對應濃度的PEM卻表現(xiàn)出了比PE更優(yōu)的抗菌性能。
2)SEM和TEM的結(jié)果顯示,PEM與PE具有相似的抗菌機理,即
12、破壞細菌的細胞壁和細胞膜結(jié)構(gòu),并使得遺傳物質(zhì)DNA發(fā)生斷裂或呈現(xiàn)濃縮緊張態(tài)。
3)細胞毒性實驗結(jié)果表明,MGF-Ct24E的引入不僅會降低材料的細胞毒性,而且會發(fā)揮MGF-Ct24E相關的生物學功能。
?、邔⑨槧畹腍A和球狀的HA按照一定比例進行混合后燒結(jié),獲得具有一定力學強度的多孔HA陶瓷支架,將PE和PEM分別與該支架進行復合后評價所得復合物的抗菌性能和生物相容性,結(jié)果如下所示:
1)FTIR和SEM結(jié)果
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