微流控芯片與可控適配體技術(shù)用于細(xì)胞代謝物分析及其相互作用的研究.pdf

1、代謝在生物系統(tǒng)中起著重要的作用。生命體組成的基本單元是細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞代謝產(chǎn)物的分析，可以了解生物系統(tǒng)的生理和病理反應(yīng)機(jī)制以及細(xì)胞間信息的傳遞，將有助于探索生命活動(dòng)的規(guī)律，為疾病的診斷與治療提供有力的依據(jù)。由于樣品基質(zhì)復(fù)雜，腫瘤標(biāo)志物的含量一般極低，細(xì)胞代謝物的分析需要高靈敏度、高選擇性的分析方法。常規(guī)細(xì)胞代謝物的分析方法往往具有操作繁瑣、分析時(shí)間長(zhǎng)、分析效率低以及成本高的缺點(diǎn)，甚至由于靈敏度低而無法進(jìn)行分析。近年來逐漸發(fā)展起來的微流控芯片

2、技術(shù)由于具有通道體積小，所需樣品量少，高通量分析的特點(diǎn)，在當(dāng)前的細(xì)胞研究中占據(jù)重要的地位。為了更好的模擬體內(nèi)微環(huán)境，本文將在微流控芯片上對(duì)體內(nèi)微環(huán)境進(jìn)行模擬并對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，開展了一系列以細(xì)胞為基礎(chǔ)的在芯片上進(jìn)行的研究。核酸適配體由于其高特異性，高親和力而廣泛應(yīng)用于蛋白、小分子乃至細(xì)胞的分析。功能核酸適配體還可以通過滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等手段對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行放大，極大的提高了分析的靈敏度。本文將在微流控芯片

3、平臺(tái)上利用核酸適配體對(duì)與疾病相關(guān)的細(xì)胞代謝物以及相應(yīng)的分子機(jī)制展開一系列的研究。具體開展了以下四個(gè)方面的工作:
　　1、將微流控芯片技術(shù)和適配體的免疫分析技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了人血漿中凝血酶的便攜式檢測(cè)。為了提高凝血酶檢測(cè)的線性范圍和靈敏度，利用核酸適配體的可控性將G-四鏈體DNAzyme與適配體組裝，并利用滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(RCA)和G-四鏈體DNAzyme實(shí)現(xiàn)信號(hào)的雙放大。同時(shí)，利用G-四鏈體DNAzyme在鐵離子的作用下快速催化AB

4、TS-H2O2，增強(qiáng)吸收，改變顏色，實(shí)現(xiàn)了人血中凝血酶的可視化分析。最終，將所建立的方法成功用于人血漿和血清中凝血酶的檢測(cè)。所建立的方法還可以用于其它腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)，并有望應(yīng)用于臨床樣品中腫瘤標(biāo)志物的分析，在疾病的診斷中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　2、利用核酸適配體對(duì)目標(biāo)標(biāo)志物進(jìn)行DNA標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)了多種標(biāo)志物的同時(shí)分析。利用核酸適配體的可控性，對(duì)VEGF165，PDGF-BB，和凝血酶，分別設(shè)計(jì)和組裝三條不同長(zhǎng)度的適配體，通過改變

5、它們的帶電量，從而改變標(biāo)志物與DNA復(fù)合物的遷移速度，使用芯片毛細(xì)管電泳進(jìn)行分離，實(shí)現(xiàn)了三種標(biāo)志物的快速定量分析。由于蛋白質(zhì)的高分子量，每個(gè)蛋白質(zhì)的帶電量固定，所以蛋白質(zhì)與配體的遷移速度之差主要由可控配體所攜帶的電子量決定。另外，假設(shè)每一個(gè)堿基攜帶一個(gè)電子，而互補(bǔ)的堿基則不帶電子，通過設(shè)計(jì)不同長(zhǎng)度的單鏈DNA，可以得到不同的帶電量，從而可以改變適配體的遷移速度，以及配體與蛋白質(zhì)復(fù)合物在芯片毛細(xì)管電泳中的遷移速度。由于細(xì)胞代謝物基質(zhì)的復(fù)雜

6、性，會(huì)影響三種標(biāo)志物的分離度。為了提高分離度，減少基質(zhì)的干擾，實(shí)現(xiàn)定性定量分析，引入了一條低分子量的DNA和一條非特異性的DNA作為內(nèi)標(biāo)物并抑制干擾。最終實(shí)現(xiàn)了不同細(xì)胞中三種代謝物的分析檢測(cè)，有望將所建立的方法用于其它小分子代謝物的分析，為疾病的診斷、腫瘤的發(fā)生發(fā)展檢測(cè)以及新標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和藥物篩選提供新的方法和手段。
　　3、構(gòu)建一個(gè)集成化的微流控芯片，用于細(xì)胞的共培養(yǎng)、缺？氧誘導(dǎo)以及代謝物VEGF165的在線分析。兩層的微流控芯

7、片用于構(gòu)建氧梯度微環(huán)境和代謝物的在線檢測(cè)裝置。細(xì)胞培養(yǎng)箱中不同長(zhǎng)度的連接通道用于考察距離對(duì)細(xì)胞間相互作用的影響。分別用5％，15％和20％的氧含量對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激，不僅對(duì)細(xì)胞的形態(tài)、增殖率和凋亡進(jìn)行了觀察，還研究了不同氧含量對(duì)活性氧、分泌物VEGF165蛋白表達(dá)量變化的影響以及已經(jīng)相關(guān)基因（HIF-1α和VEGF165）的研究，深入探索了細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)，為宮頸癌的研究提供了一些依據(jù)。
　　4、設(shè)計(jì)了一種簡(jiǎn)單的微流控芯片，實(shí)現(xiàn)了三種

8、物質(zhì)的快速混合，并將其用于VEGF165和可控適配體之間的動(dòng)力學(xué)研究。其中，微流控芯片主要包含了三個(gè)不同功能的單元結(jié)構(gòu):(1)在混合區(qū)前端的三個(gè)進(jìn)樣通道上各自加入一段蛇形通道，用于減少進(jìn)樣帶來的壓力和流速的偏差。(2)為了加快VEGF165、可控配體以及銥復(fù)合物熒光探針的快速混合，再設(shè)計(jì)一段40微米寬的混合區(qū)域。(3)在混合區(qū)域后面再加一段長(zhǎng)的蛇形通道，這樣不僅能夠使三種物質(zhì)完全混合，還可以通過選擇不同的位置來觀察VEGF165與可控配

9、體之間的動(dòng)力學(xué)變化情況。通過構(gòu)建對(duì)G-四鏈體結(jié)構(gòu)有高選擇性的銥復(fù)合物熒光探針，設(shè)計(jì)和組裝VEGF165適配體和G-四鏈體的可控配體，實(shí)現(xiàn)了VEGF165與可控配體之間動(dòng)力學(xué)的研究，并用于細(xì)胞代謝物中VEGF165的分析檢測(cè)。最后，將所建立的方法用于研究在紫杉醇刺激下，宮頸癌細(xì)胞CaSki中VEGF165的含量變化，為宮頸癌的機(jī)理研究和藥物作用研究提供依據(jù)。
　　5、在分析檢測(cè)中，雖然蛋白質(zhì)的檢測(cè)以及藥物的檢測(cè)都有單獨(dú)相應(yīng)的檢測(cè)方法

10、，但是目前還沒有相應(yīng)的檢測(cè)方法或者平臺(tái)能同時(shí)實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的檢測(cè)和藥物的代謝檢測(cè)。本課題以VEGF165、PDGF-BB以及凝血酶為檢測(cè)目標(biāo)物，將紫杉醇作用于共培養(yǎng)下的宮頸癌和內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而考察它們的相關(guān)代謝物。為了實(shí)現(xiàn)高選擇性分析以及特異性捕獲，我們利用核酸適配體進(jìn)行目標(biāo)物的捕獲和檢測(cè)。同時(shí)利用滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(RCA)和G-四鏈體DNAzyme來提高分析的靈敏度。在分析的平臺(tái)上集成了質(zhì)譜和熒光顯微鏡，不僅可以實(shí)現(xiàn)代謝物的分析，還可以對(duì)細(xì)胞的