生物轉(zhuǎn)化法產(chǎn)γ-氨基丁酸菌種篩選及條件優(yōu)化.pdf

1、γ-氨基丁酸（GABA）作為大腦組織重要的抑制性遞質(zhì)，具有鎮(zhèn)靜安神，降低血壓，治療癲癇和抗衰老的功能。此外，GABA味甜，能夠調(diào)節(jié)食品味道，可以與體內(nèi)酒精反應(yīng)，故具有醒酒消臭等作用。在醫(yī)學(xué)上，可用于治療一些病癥，如治療尿毒癥、CO中毒的藥物中都含有GABA。
　　GABA的合成方法主要有化學(xué)合成法和生物合成法，在化學(xué)法合成GABA的過程中，需要用到強(qiáng)酸或強(qiáng)堿等腐蝕性較強(qiáng)的溶劑，反應(yīng)條件劇烈，原料毒性大，價(jià)格昂貴且存在較多安全隱患等

2、問題。實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中，主要用生物法合成GABA。生物合成法主要研究的微生物法。微生物法包括傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵法以及最近幾年新興的微生物轉(zhuǎn)化法。早期的發(fā)酵法主要是以大腸桿菌（Escherichia coli）發(fā)酵生產(chǎn)GABA為主。出于對(duì)食品安全性的考慮，后來又逐漸篩選到含有谷氨酸脫羧酶的酵母菌、乳酸菌和曲霉菌等食品安全級(jí)微生物來發(fā)酵制的GABA。但發(fā)酵法生產(chǎn)GAGA過程中易污染、可重復(fù)性差，周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)也逐漸被工業(yè)生產(chǎn)所淘汰。本實(shí)驗(yàn)從用微生

3、物轉(zhuǎn)化法，主要從菌種選育，產(chǎn)酶條件以及轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行研究。結(jié)果如下:
　　本實(shí)驗(yàn)從實(shí)驗(yàn)室保藏的11株霉菌中，進(jìn)行分離純化，并且通過初篩選出兩株GABA產(chǎn)量相對(duì)較高的菌株MZ-2和MZ-7。進(jìn)一步復(fù)篩，通過Berthelot比色法作為測(cè)量方法。以GABA產(chǎn)量、L-Glu負(fù)流量以及L-Glu摩爾轉(zhuǎn)化率作為測(cè)量指標(biāo)，最終確定MZ-2作為下一步紫外誘變?cè)囼?yàn)的出發(fā)菌株。對(duì)MZ-2進(jìn)行紫外誘變，最終確定4~5 min為最佳照射時(shí)間，對(duì)誘變后的菌

4、株進(jìn)行L-Glu轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，得到一株菌株（編號(hào)UV-5），GABA產(chǎn)量達(dá)1.95 g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率也高達(dá)17.5％。進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)，其性狀可以穩(wěn)定性遺傳，可作為后續(xù)試驗(yàn)的出發(fā)菌株。通過紙層析、SBA-40D生物傳感分析儀以及比色法對(duì)轉(zhuǎn)化液中各成分進(jìn)行定性、定量分析。結(jié)果顯示，L-Glu在轉(zhuǎn)化過程中含量減少，GABA含量增多。說明菌株 UV-5具有GAD活性，可以轉(zhuǎn)化 L-Glu生成GABA。并且其 GAD活性比其他菌株的都要高。

5、r>　　通過單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)菌株UV-5最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基各個(gè)成分進(jìn)行研究，得到最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基組分：2％葡萄糖為碳源，1.2％玉米漿為氮源、0.75％氯化鈣、0.5g/L磷酸氫二鉀、0.4％L-谷氨酸。通過單因素以及正交實(shí)驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)條件為：接種種齡20 h，接種量為6％，pH值為5，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時(shí)間為72 h。在優(yōu)化培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件的情況下，UV-5轉(zhuǎn)化L-谷氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率高達(dá)27.13％。
　　對(duì)突

6、變株UV-5轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化，首先通過單因素實(shí)驗(yàn)初步確定最佳轉(zhuǎn)化條件：緩沖液選擇醋酸-醋酸鈉體系；最佳轉(zhuǎn)化溫度36℃；最佳pH值為5.0；菌體濃度6％；最佳搖床轉(zhuǎn)速180 r/min；L-Glu底物濃度0.1 mol/L；時(shí)間為14 h。以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，利用響應(yīng)面法優(yōu)化谷氨酸的轉(zhuǎn)化條件。通過PB實(shí)驗(yàn)選定轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，三個(gè)影響摩爾轉(zhuǎn)化率明顯的因素：溫度，時(shí)間，pH值。通過響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果并且根據(jù)實(shí)際情況，我們選取最佳的pH5.07，溫