熒光探針?lè)肿覶NP-AMP識(shí)別藍(lán)藻FBPase抑制劑作用位點(diǎn)的研究.pdf

1、藍(lán)藻水華在中國(guó)分布廣，對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)、人體健康以及旅游經(jīng)濟(jì)均會(huì)造成嚴(yán)重危害。尋找高專一性、高效率又環(huán)境友好的殺藻劑，已經(jīng)成為治理藍(lán)藻水華的重要需求。研發(fā)有針對(duì)性、高專一性的抑制劑，不僅需要選擇適宜的作用靶標(biāo)，還需研究抑制劑與靶標(biāo)的結(jié)合模式。
　　藍(lán)藻果糖-1，6-二磷酸酶（后簡(jiǎn)寫為FBPase）在藍(lán)藻體內(nèi)含量極少，卻在光合作用的Calvin循環(huán)中起到了至關(guān)重要的作用，而且其序列和結(jié)構(gòu)與動(dòng)植物體內(nèi)所含F(xiàn)BPase存在著較大差異，故可作

2、為殺藻劑的潛在作用靶標(biāo)。
　　抑制劑與藍(lán)藻FBPase有兩種不同的結(jié)合位點(diǎn):底物位點(diǎn)和變構(gòu)位點(diǎn)。探究抑制劑與藍(lán)藻FBPase的結(jié)合位點(diǎn)，是研究其與藍(lán)藻FBPase結(jié)合模式的基礎(chǔ)。本文將熒光探針?lè)肿覶NP-AMP與藍(lán)藻FBPase結(jié)合，按照一定組合模式加入FBP、AMP和抑制劑，通過(guò)觀察熒光的猝滅現(xiàn)象，建立了用于初步判斷抑制劑結(jié)合位點(diǎn)的方法。
　　本文主要進(jìn)行了以下幾方面工作:
　　1.以pET-28a(+)為表達(dá)載體、

3、以大腸桿菌E.Coli BL21(DE3)為表達(dá)菌株，對(duì)藍(lán)藻FBPase進(jìn)行了異源表達(dá)，并利用親和層析方法對(duì)所得目的蛋白進(jìn)行純化，最終通過(guò)SDS-PAGE電泳驗(yàn)證其純度，其產(chǎn)量為18.6 mg/L(培養(yǎng)基)。
　　2.探索不同條件對(duì)熒光探針?lè)肿覶NP-AMP結(jié)合藍(lán)藻FBPase體系的熒光強(qiáng)度的影響，最終建立了TNP-AMP結(jié)合藍(lán)藻FBPase熒光測(cè)定體系，具體條件為溫度T=30℃，酸堿性pH=8.0，熒光探針?lè)肿覶NP-AMP終濃

4、度為12.9μM，藍(lán)藻FBPase最適終濃度為15μM，金屬離子Mn2+最適終濃度為400μM。
　　3.探究了金屬離子分別對(duì)單獨(dú)的熒光染料或者藍(lán)藻FBPase的熒光強(qiáng)度的影響，最終認(rèn)為熒光探針?lè)肿覶NP-AMP結(jié)合藍(lán)藻FBPase的體系中加入金屬離子之所以會(huì)引起熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)，是因?yàn)榻饘匐x子能使藍(lán)藻FBPase的構(gòu)象發(fā)生一定程度的轉(zhuǎn)變，從而與熒光探針?lè)肿覶NP-AMP更好的結(jié)合。
　　4.在前述熒光測(cè)定體系中，通過(guò)加入已知

5、結(jié)合位點(diǎn)為底物位點(diǎn)的FBP和已知結(jié)合位點(diǎn)為變構(gòu)位點(diǎn)的AMP兩種化合物，觀測(cè)熒光的猝滅，得出結(jié)論:熒光探針?lè)肿覶NP-AMP不僅結(jié)合于藍(lán)藻FBPase的變構(gòu)位點(diǎn)，也結(jié)合于其底物位點(diǎn)。
　　5.探索有望用于初步判斷藍(lán)藻FBPase抑制劑的結(jié)合位點(diǎn)的方法，并利用已知結(jié)合位點(diǎn)為底物位點(diǎn)的F6P化合物對(duì)此方法的準(zhǔn)確性和可行性進(jìn)行了驗(yàn)證。
　　6.依次對(duì)hs，hx和x系列化合物以藍(lán)藻FBPase為靶標(biāo)進(jìn)行初篩，通過(guò)分析初篩結(jié)果，選取x系