泛PI3K抑制劑BKM120聯(lián)合PARP抑制劑Olaparib靶向治療卵巢癌的作用及其分子機制研究.pdf

1、卵巢癌在婦科腫瘤中的發(fā)病率位居第三位，死亡率位居首位。原發(fā)性卵巢癌發(fā)病隱匿，早期診斷困難，80％患者就診時已為晚期，盡管經(jīng)過手術(shù)和化療可達到完全緩解，但多數(shù)晚期患者仍會在短期內(nèi)復(fù)發(fā)，最終衍變?yōu)榛熌退幎劳觥Ｆ淇傮w5年生存率在僅30%左右。因此尋找高效低毒的分子靶向藥物，提高卵巢癌治療療效，降低卵巢癌死亡率是亟待解決的重大問題。
　　PI3K通路是調(diào)節(jié)細胞生長，增殖和生存能力等重要細胞功能的信號通路。在體內(nèi)和體外研究表明，一些 P

2、I3K抑制劑在卵巢癌中無論是作為單藥還是和細胞毒性抗癌試劑聯(lián)合使用均表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤作用。BKM120是一種泛 PI3K抑制劑，在I/II期臨床試驗結(jié)果表明，BKM120對PI3K通路正?；虍惓＜せ畹母鞣N腫瘤具有抗腫瘤的治療效應(yīng)。在細胞系和腫瘤異種移植模型中也顯示出抗增殖，促凋亡的活性。另外，抑制PI3K通路影響DNA雙鏈損傷修復(fù)的同源重組過程。
　　多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）抑制劑是被 FDA批準的第一個作為治療B

3、RCA突變的晚期卵巢癌靶向治療藥物。PARP是 DNA單鏈斷裂（SSB）修復(fù)的關(guān)鍵分子之一，參與基因組的完整性的監(jiān)控和修復(fù)。BRCA蛋白是 DNA雙鏈斷裂（DSB）后進行同源重組（HR）過程中的關(guān)鍵蛋白。BRCA1通過介導(dǎo) HR修復(fù)過程具抑癌活性。BRCA基因缺陷的細胞表現(xiàn)出對 PARP抑制高度敏感性，引起基因組不穩(wěn)定和細胞凋亡。PARP抑制劑Olaparib和PI3K抑制劑BKM120聯(lián)合應(yīng)用對 BRCA1基因缺陷或正常的乳腺癌及 P

4、TEN和 P53缺陷的激素不敏感型前列腺癌具有協(xié)同抗癌作用。有關(guān)BKM120和Olaparib聯(lián)合應(yīng)用治療卵巢癌療效及其作用機制并不十分清楚，本研究，將探討該聯(lián)合治療方案在體外和體內(nèi)治療卵巢癌的潛在機制，明確該聯(lián)合治療方案的適用人群。
　　目的：
　　多種信號通路的異常激活影響著卵巢癌的發(fā)生發(fā)展，其中PI3K信號通路40%卵巢癌病例中有異常改變。PI3K和PARP抑制聯(lián)合治療方案已以臨床前實驗被證明在BRCA基因表達正常的乳

5、腺癌和前列腺癌有較好療效。然而，關(guān)于該聯(lián)合治療方案對于卵巢癌的療效是有限的。本研究分別對同時抑制PI3K通路和PARP對PIK3CA突變的卵巢癌細胞和PIK3CA野生型卵巢癌的抗癌的療效和機制進行研究。
　　方法：
　　用PI3K抑制劑BKM120和PARP抑制劑Olaparib單獨或聯(lián)合處理11種卵巢癌細胞系，采用克隆形成實驗觀察對卵巢癌細胞的抑制效率，分析攜帶不同基因特點的卵巢癌細胞之間存在的差異。
　?。?）選擇

6、攜帶PIK3CA突變的卵巢癌細胞系SKOV3、HEYA8、IGROV1和EFO27細胞系；采用CCK-8分析方法估算BKM120和Olaparib單獨或聯(lián)合應(yīng)用對這4種卵巢癌細胞活性影響；利用彗星實驗、免疫熒光和免疫印跡法（Western Blot）實驗觀察BKM120和Olaparib單獨或聯(lián)合應(yīng)用對4種卵巢癌細胞DNA損傷和修復(fù)過程的影響；利用流式細胞術(shù)觀察這種治療方案對細胞凋亡的影響；Western Blot技術(shù)探討這種治療方案對

7、PI3K/AKT/mTOR通路及凋亡的相關(guān)蛋白表達量影響；利用劃痕實驗、遷移和侵襲實驗觀察這種治療方案對卵巢癌的細胞遷移和侵襲生物活性的影響；利用real-time RT-PCR技術(shù)檢測BRCA1/2表達情況；將用Luciferase標記的SKOV3細胞行腹腔注射制備卵巢癌腹腔播散模型，在此模型的基礎(chǔ)上用BKM120和Olaparib單獨或聯(lián)合治療，用免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察PI3K/AKT/mTOR通路、凋亡的相關(guān)及BRCA1等蛋白表達情

8、況。
　?。?）用BKM120和/或PARP抑制劑Olaparib處理3種攜帶野生型PIK3CA基因的卵巢癌細胞株，用CCK8方法、免疫印跡法，彗星試驗，流式細胞術(shù)、免疫熒光技術(shù)對觀察藥物對細胞活性、增殖和DNA損傷修復(fù)的影響。用聯(lián)合指數(shù)（combination index,CI）分析BKM120和Olaparib對卵巢癌細胞的協(xié)同抑制作用。建立人類卵巢癌組織體外培養(yǎng)模型，給予BKM120和/或PARP抑制劑Olaparib處理后

9、，用免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察PI3K/AKT/mTOR通路、凋亡的相關(guān)及 BRCA1等蛋白表達情況。
　　結(jié)果：
　　我們結(jié)合文獻及數(shù)據(jù)庫有關(guān)這11種卵巢癌細胞的全基因組測序結(jié)果，選定與 PI3K信號通路相關(guān)的基因（即K-ras、p53、PIK3CA、PTEN和 EGFR等）進行分析，結(jié)果提示不能確定某一個單一突變基因與腫瘤細胞對 BKM120治療反應(yīng)之間具有明顯的關(guān)聯(lián)性。因些，我們分別選擇 PIK3CA突變和野生型卵巢癌細胞系

10、做后續(xù)實驗。
　?。?）PI3K抑制劑BKM120有效抑制卵巢癌細胞的增殖，BKM120可導(dǎo)致γH2AX增加，使同源重組修復(fù)蛋白RAD51表達量降。聯(lián)合抑制PI3K和PARP的有效協(xié)同抑制攜帶PIK3CA突變卵巢癌細胞（包括SKOV3、HEYA8和IGROV1）的增殖、存活和遷移。與PARP或PI3K抑制劑單獨處理相比，聯(lián)合用藥處理可引起更強的DNA損傷反應(yīng)、更大幅度降低PI3K/mTOR信號及ERK的磷酸化水平升高。值得注意的是

11、，對卵巢癌細胞進行PI3K和PARP同時抑制可以顯著降低BRCA1/2表達。此外，該聯(lián)合治療方案的效果在腹腔內(nèi)播散移植瘤小鼠模型中被證實，抑制PI3K/AKT信號使SKOV3卵巢癌細胞BRCA1的表達顯著降低，減少腫瘤負荷。BKM120聯(lián)合Olaparib處理 EFO27細胞并沒有得到相同結(jié)果。與其他三種卵巢癌細胞相比，EFO27細胞對BKM120和Olaparib聯(lián)合治療方案表現(xiàn)耐藥。
　　（2）聯(lián)合抑制PI3K通路和PARP可

12、有效協(xié)同抑制PIK3CA野生型卵巢癌細胞株（OVCA433，OVCAR5，和OVCAR8）的增殖。BKM120聯(lián)合Olaparib誘導(dǎo)PIK3CA野生型卵巢癌細胞凋亡。BKM120聯(lián)合Olaparib誘導(dǎo)PIK3CA野生型卵巢癌細胞的 pS6RP大副度降低和增強DNA損傷反應(yīng)。值得注意的是，雙重抑制 PI3K通路和 PARP可使這些卵巢癌細胞的BRCA1/2表達顯著降低。此外，對人類卵巢癌的移植體體外培養(yǎng)，暴露BKM120和Olapar

13、ib后可顯著抑制癌細胞的增殖、促進癌細胞凋亡，并伴隨BRCA1表達降低。
　　結(jié)論：
　?。?）聯(lián)合抑制PI3K通路和PARP是治療PIK3CA突變卵巢癌有效方案；同時，PI3K抑制劑使BRCA下調(diào)可以作為評估聯(lián)合使用PARP抑制是否會有效的生物標記物。
　　（2）聯(lián)合抑制PI3K通路和PARP可有效治療PIK3CA野生型卵巢癌，而不依賴于BRCA1/2基因狀態(tài)。提示，BKM120聯(lián)合Olaparib應(yīng)用可有效治療的卵